物质含氮量的测定——微量凯氏定氮法.doc

生物物质含氮量的测定微量凯氏定氮法一、目的1、了解微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。2、掌握本试验的操作步骤。二、原理1. 生物材料中含有许多含氮的有机物,如蛋白质、核酸、氨基酸等，故含氮量的测定在生化研究中十分重要。知道了含氮量，就可推知蛋白质量。本法适于测定0.22.0毫克的氮。2. 有机物与浓硫酸共热,有机物转变为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵,后者与强碱作用释放出氨,借蒸汽将氨蒸至硫酸液中和的浓度，即可计算出样品的含氮量。3. 本实验用直接法来判断中和程度。用硼酸作为氨的吸收溶液，结果使溶液中氢离子降低，混合指示剂(pH4.3pH5.4)由黑紫色变成绿色。再用标准酸来滴定,使硼酸恢复到原来的氢离子的浓度为止,指示剂出现淡紫色终点,此时所耗的盐酸量为氨的量。NH3+H3BO4 NH4H2BO4 NH4H2BO4+HCl NH4Cl+H3BO44. 为了加速消化，可加入CuSO4作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高溶液的沸点。此外硒汞混合物或钼酸钠可作为催化剂，且缩短作用时间，H2O2也可加速反应。 三、试剂和器材1、试剂的配制（1）样液 7.5g蛋清溶于0.9% NaCl液,并以生理盐水稀释至100ml。如有不溶物，离心取上清备用，即为7.50%的鸡蛋清溶液。（2）30% 氢氧化钠溶液（3）2% 硼酸溶液（4）混合指示剂 （5）1mol/L标准盐酸溶液2、材料 硫酸（A.R.）、硫酸钾：硫酸铜=3：1（W：W）混匀研成粉末、凯氏定氮管、凯氏定氮仪。 四、操作1、消化 每人1支凯氏定氮管编号，第1、2组加1.0ml蒸馏水作为空白对照，其他各组加1.0ml鸡蛋清样液。然后加硫酸钾-硫酸铜混合物约20mg及浓硫酸2ml，并放入3-4粒玻璃珠，放在消化炉上加热消化。开始时应控制火力，将消化温度控制在1505 min，然后再增加至200，消化10 min。注意勿使瓶内液体冲至瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解释放出SO2白烟后，适当加强火力至300消化10 min，然后增加火力至450，直至消化液透明并呈淡绿色为止（1.5-2 h），冷却，准备蒸馏。 2、蒸馏 每人取50-100ml锥瓶1个，先按一般方法洗净，再用蒸汽洗涤3次，每次15-20s，冷却，用吸管各加入2%硼酸溶液5.0ml及指示剂2-3滴。如瓶内液体呈葡萄紫色，盖好备用。如锥形瓶内液体呈绿色，需要蒸汽重新洗涤。将装有消化液的消化管，加入定氮仪左边反应室，再在冷凝管下置一盛有硼酸液及指示剂的锥形瓶，并使冷凝管口插入酸液面下约0.5 cm处。打开碱开关，通入10-15ml的30%NaOH溶液，让NaOH液缓缓流入反应室内的消化管中。关掉通碱开关，打开通气阀开始蒸馏。开始蒸馏后，即应注意硼酸溶液颜色的变化。当酸液由葡萄紫色变成绿色后，再蒸馏20s，若绿色不变，降低锥形瓶，使冷凝管口离开酸液液面约1cm，再通气数秒钟（让凝管口上的溶液进入锥形瓶）后关掉通气阀，移去锥形瓶，盖好，准备滴定。 3、滴定 用0.01mol/L的HCl溶液滴定锥形瓶中的硼酸溶液至浅葡萄紫色，记录所耗HCl溶液的量。 4、计算蛋白量=(A-B)10-3M14.0086.25 100/7.5 即为每g鸡蛋清中所含的蛋白质的量 A=滴定样品用去的HCl液ml数； B=滴定空白用去的HCl液ml数； M=滴定所用盐酸的摩尔浓度； 14.008=氮之原子量。 五、思考题1、本实验有哪些注意事项？2、根据实验结果请计算出每克鸡蛋清溶液中含有的蛋白质的量和百分含量。3、在实验操作过程中，NaOH溶液若通的过多，对实验结果有什么影响？附：一些常见食物的产氨量各种食物含氮量 食物含氮量氨氮/总氮食物含氮量氨氮/总氮大米0.3200.04长豇豆0.1600.46面包0.3200.94甜薯0.2880.61玉米屑0.1290.01洋白菜0.2080.82咸肉4.8640.33胡萝卜0.1760.81鸡肉3.8080.45菜花0.3021.41火腿2.7040.58芹菜0.1440.01汉堡包3.8720.26黄瓜0.1443.27乳酪0.5762.75菠菜0.4800.20牛奶0.5600.35青豆1.0080.60蛋清0.7440.05西红柿0.1672.09蛋黄2.5600.16南瓜0.1924.28苹果0.0320.36马铃薯0.4162.33香蕉0.1760.01莴苣0.1440.55葡萄柚0.8002.07扁豆1.3440.21葡萄0.2084.20鲜蘑0.3042.18桃0.0643.78葱头0.24011.20梨0.1122.67小萝卜0.16