灯盏花根腐病.doc

英特尔大书房 开启一站式检索时代大数据（Big Data） 云计算（Cloud） 移动性（Mobility） 其他（Others）8期 杜 宾等：云南灯盏花根腐病病原初步鉴定 1831 南和广西等高山和亚高山开阔山坡草地和林缘地区。始载于滇南本草1，民间的使用已有600年的历史。性味辛、微苦、温，具有散寒解表，祛风除湿，活络止痛的作用。可以抑制蛋白激酶的激活，防治神经元缺血性损失。通过降低缺血脑组织内中性粒细胞的粘附浸润对脑缺血有保护作用。灯盏花制剂自20世纪70年代开始应用于临床上，主要用于治疗高血压、脑栓塞、多发性神经炎、慢性视网膜炎及意外所致的瘫痪症，被临床称为“脑血管疾病的特效药”，1977年被列入中华人民共和国药典中，是云南省“十五”期间重点培育的五大“云药”系列特色产品之一。灯盏花原为野生，随着市场对灯盏花及其制剂需求量的剧增和可观的经济效益，近年来开始了人工大面积栽培26。 但是随着灯盏花人工栽培规模的不断扩大，根腐病的危害也逐年加重，已经成为制约其大规模生产的主要因素之一。【前人研究进展】该病害目前在国内外尚未见报道。【本研究的切入点】确定引起灯盏花根腐病的病原物，为制定高效、安全的防治措施提供依据。【拟解决的关键问题】通过对灯盏花根腐病的症状进行观察、描述，对其病原物进行分离、培养和鉴定。 1 材料与方法 1.1 供试灯盏花种源 云南生物谷灯盏花药业有限公司昆明栽培基地种植的灯盏花，是从云南省文山州邱北县采集，经过3年驯化栽培的种源。 1.2 病原菌的分离 采集发病灯盏花植株的根，从病健交界处切取长约23 mm的一段，用75%的酒精浸泡56 s，再在0.1%的酸性升汞溶液中处理35 s，然后在灭菌水中漂洗3次，将其移置在马铃薯琼脂培养基（PDA）上培养，挑取所出现的菌落移置在斜面PDA培养基 上，然后在显微镜下进行单孢分离，保存备用7。 1.3 病原菌的鉴定 将单孢分离物在标准培养基上培养，得到其纯培养物。观察其在PDA培养基上的培养性状、质地、色泽等。在显微镜下观察检测，测量大、小两型分生孢子的形态、大小、分隔数和产孢结构，以及厚垣孢子的有无、形态和着生方式。 1.4 田间接种 在云南农业大学实验农场种植灯盏花，分布在3个不同试验点，每点1 500株苗。用无菌水冲洗培养7 d的菌落，制成孢子悬浮液（5106个孢子/ml）。灌根前用剪刀刺破健康植株的根部，每株浇灌10 ml孢子悬浮液。每个试验点随机接种5株，3个点共接种15株。每个点随机取5株采用同样的方法灌入清水，作为对照。接种的灯盏花均为生长健康旺盛的植株。 1.5 接种后病情调查 接种14 d后，将接种植株及对照全部挖出，用自来水将根部的泥土冲干净后，按以下分级标准记载发病情况： 0级：根系健康，完全无病； 1级：仅有少许根系受伤，枯死面积小于10%； 3级：根系受伤明显，枯死面积小于25%； 5级：根系枯死面积25%50%； 7级：根系枯死面积50%75%； 9级：根系枯死面积大于75%。 1.6 致病菌的再分离 取接种发病的灯盏花植株的根部，按照1.2的方法分离病原物，在PDA培养平板上获得纯培养，并与原接种菌株相比较。 2 结果与分析 2.1 灯盏花根腐病症状描述 该病原菌主要侵染灯盏花的根部和茎基部，发病初期植株地上部分不表现任何症状，但随着病情的发展，维管束被破坏，失去输水功能，开始时叶片在中午阳光强烈时萎蔫，晚上即可恢复，以后便渐渐萎蔫死亡，最终导致整株干枯。观察发病植株的根部，已部分或完全变成深黑褐色（图1），用刀片切开，可以明显看到其维管束组织变为黑褐色。 2.2 接种结果 接种的15株灯盏花植株中，根部全部出现腐烂症状，其中严重度为1级的有4株，3级的有3株，5级的有4株，7级的有2株，9级的有2株，发病率达100%。对照植株的根部生长健康，发病率为0（表1，图2）。 2.3 病原菌的鉴定 分离得到的单个分生孢子在标准培养基上生长四天后，菌落直径是3.54 cm（pH6.5，27），初生为白色，后为红色和红褐色，气生菌丝发达，棉絮状。无性繁殖产生大、小两型分生孢子，大型分生孢子较少，58 d产生，镰刀状，13个分隔，395145.2 m；小型分生孢子12 d就可以产生，并且产生1832 中 国 农 业 科 学 40卷 a：健康植株地上部分；b：发病初期地上部分；c：发病后期地上部分；d：左发病后期根部；右健康植株根部 a: Leaf of healthy plant; b: Leaf of sick plant in early period; c: Leaf of sick plant in later period; d: Left: Root of sick plant; Right: Root of health plant 图1 灯盏花根腐病田间自然发病症状 Fig. 1 Symptom of E. brevlscapus root rot in field 表1 接种后14 d灯盏花根腐病的发病率和严重度 Table 1 The severity of root rot of E. breviscapus 14 days after inoculation 严重度 Severity 处理 Treatment 0级 1级 3级 5级 7级 9级 发病率(%) Incidence 接种Inoculation 0 4 3 4 2 2 100 对照CK 15 0 0 0 0 0 0 量很大，卵形至棍棒形，没有分隔，卵形2.65.1 m，棍棒形720 m，小型分生孢子的产生方式是多芽生殖。在弱培养基（2%的水琼脂）上培养10 d产生厚垣孢子，圆形至卵形，911 m810 m，壁光滑或不光滑（图3）。上述特征与C. Booth8,9所描述的拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）的形态特征基本一致，因此初步确定其分类地位为：半知菌亚门（Deuteromycotina）丝孢纲（Hyphomycetes）瘤座菌目（Tuberculariales）镰孢菌属（Fusarium）拟枝孢镰刀菌（F.sporotrichioides）。 2.4 致病菌再分离和鉴定结果 从接种后发病的植株根部再次分离出的病原菌，其菌落的外部形态特征：如菌落质地、颜色、大小等；分生孢子的类型、大小、分隔数及形状；产孢细胞的结构等，都与原先分离得到的、用于接种的菌株完全相同。 以上过程完成了柯赫氏法则，因此初步确定本研究所采集的灯盏花根腐病是由拟枝孢镰刀菌引起（F. sporotrichioides）。 c d a b 8期 杜 宾等：云南灯盏花根腐病病原初步鉴定 1833 左为接种发病植株根部；右为对照植株根部 Left: Root of inoculated plant; Right: CK 图2 接种后植物根部症状 Fig. 2 Symptom on root of inoculated plant and CK 3 讨论 镰刀菌是一个大而可变的属，它的分类是学术界长期争论的焦点。关于镰刀菌的分类，目前国际上就有10个不同的分类系统1013，其中Booth（1971）以Wollenweberr（1935）的分类系统为基础，吸收了Snyder系统的合理成分，提出了包含44个种的分类系统，他首次采用分生孢子梗的形态和瓶梗类型作为分类的依据，得到了学术界的普遍认可。因此，本研究对于镰刀菌的分类也采用了Booth（1971）的分类 系统，并结合Nelson（1983）的分类依据（林清洪，等）10，充分考虑了大孢子的多少和形状，小孢子的有无、形状和着生方式，分生孢子梗的特征和瓶梗类型，厚垣孢子的有无和着生位置，菌落的生长速度和颜色等特征。 图3 病原物菌落、分生孢子和厚垣孢子形态 Fig. 3 The colony, conidium, chlamydospore of pathogen 根腐病是一种土壤传播病害，具有自身的复杂性， 由于土壤理化性质的影响及作物根系微生物区系的庞大，同一种植物的根腐病可能是由不同属的病原物或者是由镰刀菌属的不同种混合侵染造成的14,15，而且由于镰刀菌分类系统的复杂性，往往在病原的确定和 诊断上引起混淆。本研究对灯盏花根腐病病原的鉴定，只是针对在昆明采集的病样，其它地区灯盏花根腐病是否由拟枝孢镰刀菌引起、以及是否存在混合侵染现象还有待于今后进一步研究。 灯盏花在云南省部分地区一年四季都可种植，因 1834 中 国 农 业 科 学 40卷 此根腐病可以周年发生，没有明显的病害循环周期，年发病率大约保持在50%左右，造成大量植株枯死，对灯盏花人工栽培产业的进一步发展扩大造成了严重障碍。目前，对该病害的发生、发展及流行规律，病原物的生活史、侵染机制等方面还缺乏清楚的认识，极大地限制了我们制定安全、高效的防治措施，今后笔者将进一步加强这方面的研究。 4 结论 通过田间调查、采样，室内分离、鉴定，田间接种，接种发病后再分离、再鉴定，根据其形态特征初步确定引起云南省昆明市灯盏花根腐病的病原菌为拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides），属于半知菌亚门丝孢纲瘤座菌目镰孢菌属真菌。 拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides）为害灯盏花，引起根腐病，在国内外尚属首次报道，灯盏花是拟枝孢镰刀菌的新记录寄主。 致谢：云南农业大学植物保护学院罗文富教授、刘云龙教授在病原菌鉴定过程中、云南生物谷灯盏花药业有限公司在病害调查、标本采集中给予了极大的支持和帮助，谨此致谢。 References 1 林 镕, 陈艺林. 中国植物志(第七十四卷). 北京: 科学出版社, 1985: 308-309. 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