基因克隆与突变 培训版.doc

中国生命科学实验技术服务中心 威斯腾生物技术服务中心 专业机构，打造专业服务！ 基因克隆与基因突变技术一、 基因克隆(gene cloning)1、基因克隆的起因：基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为分、切、连、转、选。分是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；连是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；转是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；选则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行外科手术。 基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓种瓜得瓜，种豆得豆，一母生九子，九子各不同。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。 基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一s次完整地建立起了基因克隆体系。一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。 基因克隆的原理：习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便属于同一克隆。细胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子。基因定位克隆或图位克隆（map-based cloning）是用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效的方法。具体的步骤是先将目的基因，亦即目的基因的突变定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记；接着利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定的片段克隆并分离出来；最后是根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。成功地应用基因定位技术分离目的基因的一个必要条件是，以酵母人工染色体YAC（yeast artificial chromosome）为载体构建含有大片段DNA的YAC库。另一个必要的条件是要有可用的同目的的基因紧密连锁的DNA探针。酵母人工染色体（yeast artificial chromosome。YAC）载体可以数百kb的大分子量的DNA片段。YAC载体包括如下的组成部分： 一段来自酵母染色体的着丝粒序列； 一段控制酵母DNA复制的自主复制序列（autonomously replicatimg sequence，ARS）；一对酵母的端粒序列，在有的YAC载体中（例如pYAC4），这对端粒序列来自四膜（Tetrahymena）染色体；选择记号；位点。YAC载体能够如同染色体一样在酵母细胞中正常地复制，并可以大片段的外DNA，其大小至少可相当于最大的酵母染色体。应用酵母人工染色体构建真核YAC库的基本过程如下：首先选用核酸内切限制酶EcoRI和BamHI对YAC载体pYAC4作双酶消化，结果两个端粒序列之间的片段便被移走，产生出具有EcoRI粘性末端的两条臂分子。在每一条臂分子中都带有一段端粒序列和一个选择记号。同时再选用一种切割位点稀少的核酸内切限制酶，对高分子量的真核DNA作局部消化。反应物通过脉冲电场凝胶电泳或密度离心除去分子量小于200kb的DNA片段，收集剩余部分的大分子量的DNA片段，纯化后与YAC臂连接。或者是直接从电泳胶中切出含有所需分子量范围的DNA片段的胶块，从中提取DNA，并与YAC臂连接。然后再经过一次脉冲电场凝胶电泳，把含有插入序列的YAC载体分离出来，并转化给已经去掉了细胞壁的酵母细胞，即原生质球。应用存在于两臂分子上的选择基因（selectable genes），筛选含有YAC两臂的酵母。一、RFLP分子标记所谓RFLP，即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸内切限制酶切割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。由于核酸内切限制酶是以一种序列特异的方式切割DNA分子，来自一个完整的纯合子个体（所有的基因及DNA序列）的每一种同源的DNA分子，都会在同样的位点被准确地切割。从不同的生态型（ecotype）或不同的地理隔离群（geographical isolate）植株分离的总DNA中，同源DNA分子通常会表现出序列的趋异性（divergence），形成RFLP。这些RFLP是由于DNA序列上的特定变化（突变）引起的，因此它们也能够像其他任何遗传标记一样进行定位，成为一种十分有用的分子标记。RFLP作图的原理与步骤以拟南芥菜为例，简述RFLP作图的基本原理与步骤。将实验的条件限定为：两个不同的拟南芥菜生态型，即Columbia生态型和Niederzenz生态型；两个杂交探针，即基因A和基因B；一种核酸内切限制酶EcoRI。从这两个不同生态型的拟南芥菜提取的两份总DNA，经过EcoRI限制酶的切割和琼脂糖凝胶电泳分部分离之后，作Southern转移，并分别同放射性标记的探针基因A和基因B杂交。在图中可以看到，两亲本生态型的DNA，同两种探针杂交的结果都呈现出多态性现象，这说明在这两个生态型的不同大小的DNA限制片段上，都存在着基因A和基因B的序列。F1代是杂合子，正如我们预期的情况一样，它含有两亲本的限制片段。由这些F1代植株自花授粉所产生的F2代植株中，也会出现这种预期的1：2：1的分离模式。这两个基因是独立分配还是连锁分配，会表现出非常不同的结果。目前还可用其他分子标记如SSLP和CAPS等进行分子作图。二、染色体步移染色体步移的起点是具有一个与待分离的目的基因尽可能靠近的已经鉴定的分子标记。这种标记可以是RFLP，也可以是已知的基因。先构建起点RFLP标记克隆的限制图，并把其中最靠近目的基因的限制片段亚克隆出来。此限制片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针，从基因组文库中筛选与起点克隆具有重叠序列的新克隆（称之为一步克隆）。重复进行上述的各个步骤。构建一步克隆的限制图，亚克隆其中最靠近目的基因的限制片段，该片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针从文库中筛选与一步克隆具有重复序列的新克隆（称之为二步克隆）。如此重复进行多次，每得到一个新的克隆都更接近目的基因一步，直至最后获得了目的基因的克隆。由于这种技术是通过逐一来自染色体DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象地称之为染色体步移（chromosome walking）。二、基因定点突变：基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，亦称点突变。在自然条件下发生的突变叫自发突变，由人工利用物理因素或化学药剂诱发的突变叫诱发突变。基因突变是生物变异的主要原因，是生物进化的主要因素。在生产上人工诱变是产生生物新品种的重要方法。 根据基因结构的改变方式，基因突变可分为碱基置换突变和移码突变两种类型。 碱基置换突变：由一个错误的碱基对替代一个正确的碱基对的突变叫碱基置换突变。例如在DNA分子中的GC碱基对由CG或AT或TA所代替，AT碱基对由TA或GC或CG所代替。碱基替换过程只改变被替换碱基的那个密码子，也就是说每一次碱基替换只改变一个密码子，不会涉及到其他的密码子。引起碱基置换突变的原因和途径有两个。一是碱基类似物的掺入，例如在大肠杆菌培养基中加入5-溴尿嘧院（BU）后，会使DNA的一部分胸腺嘧啶被BU所取代，从而导致AT碱基对变成GC碱基对，或者GC碱基对变成AT碱基对。二是某些化学物质如亚硝酸、亚硝基胍、硫酸二乙酯和氮芥等，以及紫外线照射，也能引起碱基置换突变。 移码突变：基因中插入或者缺失一个或几个碱基对，会使DNA的阅读框架（读码框）发生改变，导致插入或缺失部位之后的所有密码子都跟着发生变化，结果产生一种异常的多肽链。移码突变诱发的原因是一些像吖啶类染料分子能插入DNA分子，使DNA复制时发生差错，导致移码突变。定点突变的步骤：通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了：第一：引物怎么设计呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到质粒呢？对于第一个问题：怎么设计引物？我只能讲一些原则，并举一些例子。引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：不过这种突变引物要加上一个原则：一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924* *|-deletion X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984*（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物对于第二个问题：怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。 关于第三个问题：直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧）定点突变注意的事情：1、根据现有基因设计引物；2、合成引物并准备好模板；3、PCR，4、DpnI处理酶切产物；5、转化酶切产物；6、筛选 阳性克隆；7、送测序并测全长。实验需知：基因克隆总价基因克隆费用测序费用基因长度 克隆载体 克隆价格 测序费用为65元/次1501000bpT载体 5001001-2000bpT载体 7002000-4000T载体 9001501000bp客户载体 7001001-2000bp客户载体 9002000-4000客户载体 10004000以上 询价 1. 请一定提供PCR原液,由我们为您免费纯化,以便于技术员分析问题 2. 送样前务必检测扩增效果,原液不少于100ul,总量不少于2ug,视片断的长度适度增加 3. 自带载体需高拷贝质粒 4. 基因特性请详细说明(如表达产物是否有毒,是否需特定的菌种培养等) 出现以下情况之一照常收费:1. 测序结果只找到一端引物,全额收费 2. 测2个阳性克隆,结果不一致,只收取一次的测序费用 3. 测2个阳性克隆,结果一致,但不是您所要的序列,只收取克隆费用,测序免费 突变费用中包含引物合成及测序的价格:突变点数1个 2个 3个 3个以上 价格1001000bp100016002400询价 1001-2000bp1500