子学习情境3干扰素发酵.doc

子学习情境3 干扰素发酵基因工程菌的发酵生产水平，不但和菌种的遗传特性有关，而且和发酵工艺控制有密切关系。基因工程药物实现工业化生产需要解决两个关键问题，一是如何构建基因工程菌使其含有外源药物基因，并且能够有效合成目标蛋白；另一个是如何实现基因工程菌的发酵工艺控制，实现目标产物的高效表达。基因工程菌株Pseudomonas putida VG84pVG3工程菌株应该具备假单胞杆菌宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下：1、宿主细胞假单胞杆菌特性(1)细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为35m。(2)菌落特征。在LB琼脂培养基上，30培养24h，其菌落直径为2.53.Omm，灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。2、生化特性不能将明胶、淀粉、聚-羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源。3、遗传特性DNA中G和C的含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸四环素和氨卡青霉素的抗性。4、生产能力具有生产干扰素- a 2b的能力，其放射性免疫学效价不低于2.OlO9IU/L。任务1 菌种库和工作菌种库的建立及保存1、菌种库的建立、传代及保存从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主代菌种库(Master cellbank,MCB)，主代菌种库不得进行选育工作。从主代菌种库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库(Working cell bank,WCB)。工作种子库也可由上一代工作种子库传出，但每次只限传三代。每批主代菌种库均进行划线LB琼脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于-70它以下温度保存。2、工作菌种库的建立及保存(1)培养基制备。生产过程中使用的培养基均按一定工艺要求配制。(2)接种、转移及培养。取12支主代菌种库菌种接大摇瓶内，摇床培养，至吸光值(OD值)为5.51.0。将己培养好的摇瓶种子液转移至种子罐中，通人无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求(OD值为8.02.0)。种子罐培养结束后，无菌操作转移到离心管中，离心l5mmn，加新鲜菌种培养基，将菌体制成菌悬液，并加入甘油使其浓度达到18%，分装于Ependorf管中，每支(1.00.2)mL。(3)保存。分装完毕，于-2O放置1620h，在-70下可保存3年。任务2 干扰素发酵工艺过程控制一、干扰素发酵工艺过程(1) 菌种制备 取-7O下保存的甘油管菌种 (工作种子批)，于室温下融化。然后，接人摇瓶，培养温度30，pH值7.0，250r/min活化培养 (18士2) h后。进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。(2)种子罐培养 将己活化的菌种接入装有 30L培养基的种子罐中，接种量为 10%，培养温度 30，pH值7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养34h，当OD值达到4.0以上时，转人到发酵罐中，进行二级放大培养，同时取样进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂茵。（3)发酵罐培养。将种子液通入 300L培养基的发酵罐中，接种量 10%，培养温度30，pH值7.0。级联调节通气量和搅拌转速。控制溶解氧为 30%，培养4h。然后控制培养温度20，pH值6.0，溶解氧为 60%，继续培养 56.5h。同时进行发酵液杂菌检查。当OD值达9.0士1.0后，用 5冷却水快速降温至15以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转人收集罐中，加人冰块使温度迅速降至10以下。(4)菌体收集。将己降温至2O 以下的发酵液转人连续流离心机，1600Or/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20冰柜中保存时。不得超过12个月。每保存 3个月，检查一次活性。整个发酵工艺过程如图4-1所示。发酵液降温生产菌种菌体收集配制培养基原料离 心菌体冷冻保存接 种发酵罐培养菌种活化蒸汽灭菌种子罐培养蒸汽灭菌蒸汽灭菌图3-1干扰素- a 2b发酵工艺流程图二、干扰素发酵工艺过程控制(1)发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5h分裂速度最快，到3.5h开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5h之后，在4h达到最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。(2)培养基组成。一般地，种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮源的含量应较高(即C/N低)。相反，对于发酵培养基，氮源含量应比种子培养基稍低 (即C/N高)。假单胞杆菌在以水解酪蛋白、酵母粉等营养丰富的合成培养基中发酵时，由于培养基提供生长所必需的碳、氮和磷源，因此生长比在基本培养基上要快。基因工程假单胞杆菌在合成培养基上显示较高的质粒稳定性，这主要是因为在基本培养基上，基因工程菌和宿主菌的比生长速率存在差异。假单胞杆菌发酵需要有合适的生长pH值范固，而其生长繁殖过程中，产生的代谢产物会引起培养基pH值的改变。因此，要考虑到培养基的pH值调节能力，可用K2HPO4/ KH2PO4缓冲液。(3)溶解氧。基因工程菌发酵要求培养液中有足够的溶解氧，为了提高发酵罐的供氧能力，往往需要增大搅拌转速，增加空气流量，或通人纯氧。氧气不足时，一般表现为乙酸、乙醇等发酵副产物的积累，同时造成菌体生长、生产速率下降。Rin，kevrtlene等发现15%的溶解氧就可满足基因工程假单胞杆菌的生长需求，但70%以上的溶解氧水平才能保证菌体中干扰素-a2b的大量合成，其产量是15%溶解氧的6倍，而菌体生长速率末发生明显变化，质粒稳定性也有很大的提高。因此可采用两段培养的策略，分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以提高干扰素的发酵水平。(4)温度 假单胞杆菌的生长最适温度与产物形成的最适温度是不同的。稳定而适中的温度既能保证菌体细胞膜的完整和细胞中酶的催化活性，又有利于提高干扰素的产量。对于采用温度控制基因表达或质粒复制的基因工程菌。友酵过程一般分为生长和表达两个阶段。基因工程假单胞汗菌发酵温度控制在2O可以有效防止干扰素-a2b的降解而其最佳生长温度则为30。质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以减少目标产物的降解。(5)pH值 发酵过程中，pH值的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。有研究表明pH值对大肠杆菌K802(pLY-4)生长和生产的影响不同。pH值6.8时菌体生长最佳，而干扰素y的最佳衷达pH值为60，采用两段培养法，在生长和生产阶段分别控制在各自最佳pH值，对提高干扰素的发酵水平非常有利。而干扰素-a的等电点在pH值60附近，在低酸性条件下稳定，能耐受pH值245的酸性环境，因此可在发酵后期降低pH值，从而造成大量蛋白酶失活，减少干扰素-0的水解，提高干扰素的积祟量。(6)发酵过程中泡沫的形成与控制 发酵培养液内含有各种易产生泡沫的蛋白质，它们与通气搅拌所产生的小气泡混合，使发酵产生一定数量的泡沫。随着菌体繁殖，使整个发酵过程形成过多和稳定持久的泡沫。气泡内的空气有隔热作用。造成培养及灭菌不彻底。泡沫多时会从排气口甚至从轴封中溢出容易造成染菌。一般应通过机械搅拌和加大少量表面活性剂来消除泡沫。任务3干扰素的分离纯化工艺过程一、基因工程干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离与纯化分为两个阶段，初级分离阶段和纯化精制阶段。初级分离阶段在假单胞杆菌发酵之后。其任务是分离细胞和培养液、破碎细胞和释放干扰素(于扰素存在于细胞内)，浓缩产物和除去大部分杂质。干扰素的纯化精制阶段是在初级分离基础之上，用各种高选择性手段(主要是各种色谱技术万将干扰素和各种杂质尽可能分开。使干扰素的纯度达到要求。最后制成成品。整个分离纯化过程所要注意的主要问题是怎样保持干扰素的活性。蛋白质失活的机理概括起来有两点:第一点，一级结构被破坏，导致三维结构的变化，造成失活。主要机理有肽键的酸水解(在Asp的羟基侧链上最迅速)。CyS、Trp、Met的氧化，二硫键被还原，巯基与金属离子作用形成硫醇盐，Asn和Gln脱酰胺作用，氨基酸的消旋作用，Pro的异构化；第二点，如果一级结构没被破坏，三级和四级结构的变化也可能导致失活。主要机埋有聚集(有时伴随分子和分子间二硫键的形成)，酶失去辅酶，寡聚蛋白质解离成单体，吸附于容器表面，不正确的折叠形式或形成错配的二硫键。蛋白质活性损失的原因有很多，一般有以下因素:温度、流体状态、摩擦、剪切力、吸附、截流率、pH和介质条件、溶液中气体、微生物、活性抑制剂等。1、干扰素分离工艺过程(1)菌体裂解。用纯化水配制裂解缓冲液，置于冷室内，降温至21O。将-2O冷冻的菌体破碎成2cm以下的碎块，加人到裂解缓冲液(pH7.0)中，21O下搅拌2h，利用冰冻复融分散，将细胞完全破裂，释放干扰素蛋白。(2)沉淀。向裂解液中加人聚乙烯亚胺。21O下气动搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。然后，向裂解液中再加入醋酸钙溶液，21O。CT气动搅拌l5min。对菌体碎片、DNA等进行沉淀。(3)离心。在21O，将悬浮液在连续流离心机上160OOr/min离心。收集含有目标蛋白质的上清液，细胞壁等杂质沉淀在121蒸汽灭菌30min后焚烧处理。(4)盐析。将收集的上清液用4mol/L硫酸镀进行盐析，21O搅匀静置过夜。(5)离心与储存。将盐析液在连续流离心机上于1600Or/min离心，沉淀即为粗干扰素，放人聚乙烯瓶中。于4冰箱保存(不得超过3个月)。2、干扰素分离工艺过程控制(1)使用保护剂。因为干扰素中的琉基极易被氧化形成二硫键。所以必需使用琉基试剂如硫二乙醇(C4H10O2S)加以保护。金属离子是酶的激活剂和辅助因子，加人金属整合剂EDTA(C10H16N2O2,乙二胺四乙酸)可除去金属离子，从而抑制酶的活性。PMSF(苯甲基磺酰氟)是丝氨酸蛋白酶和疏基蛋白酶的抑制剂。加入PMSF保护目标产物以免被水解。(2)使用絮凝剂。加入聚乙烯亚胺产生絮凝作用。影响絮凝的因素有絮凝剂的种类、用量、溶液pH、搅拌速度和时间等。絮凝剂用量是重要的因素，在较低浓度下，增加用量有利于架桥作用，提高絮凝效果。但絮凝剂用量过多会吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层而失去与其他胶粒架桥的作用，造成胶粒再次稳定的现象，降低絮凝效果。过量的絮凝剂会将核酸包围起来，无法实现大范围搭桥作用的沉淀，同时也会包裹一些目标产物，造成损失。高剪切力会打碎絮团，因此适当的搅拌时间和速度可以提高絮凝效果。加人絮凝剂时，注意不要使溶液局部絮凝剂的浓度过高，浓度过高会削弱沉淀的作用。(3)使用凝聚剂。加人乙酸钙产生凝聚作用。菌体及其碎片大多带负电，由于静电引力作用将溶液中的带正电的粒子吸附在周围，形成双电层的结构，水化作用是胶体稳定存在的一个重要原因。加人乙酸钙的作用是破坏双电层和水化层，使粒子间的静电排斥力不足以抵抗范德华力而聚集起来。3、干扰素纯化工艺过程(1)配制纯化缓冲液。用超纯水配制纯化缓冲液，配制完毕后经过0.45m滤器和1Oku超滤系统过滤，在百级层流下进行收集。超滤后，将缓冲液送到冷室，冷却至21O。使用前应重新检查缓冲液的pH和电导值，准确无误方可使用。(2)溶解粗干扰素。在21O将粗干扰素倒人匀浆器中，加pH7.5磷酸缓冲液，匀浆，使之完全溶解。(3)沉淀除杂质。待粗干扰素完全溶解后，用磷酸将溶液调节至pH5.0，进行蛋白质等电点沉淀。(4)离心。将悬浮液在连续流离心机上于160OOr/min离心，收集上清液。(5)疏水层析。用NaOH调节上清液pH7.0。并用5mol/LNaCl调节溶液电导值18OmS/cm，上样，进行疏水层析，利用于扰素的疏水性进行吸附。在21O，用0.025mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)和1.6mol/LNaCl进行冲洗，除去非疏水性蛋白，然后用0.Olmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液。(6)沉淀。用磷酸调节洗脱液pH4.5，调节洗脱液的电导值为4OmS/cm，搅拌均匀后21O静置过夜(l2h)，进行等电点沉淀。(7)过滤。将沉淀悬浮液用10OOku的超滤膜进行过滤，在21O进行收集滤液。(8)透析。调整溶液pH8.0，电导值5.OmS/cm，在lOku的超滤膜上。21O用0.0O5mol/L，缓冲液透析。(9)阴离子交换层析。上样前，先用0.Olmol/L，磷酸缓冲液(pH8.0)平衡树脂。上样后，用相同缓冲液冲洗，采用盐浓度线性梯度55OmS/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰，在21O进行。(10)浓缩和透析。合并阴离子交换层析洗脱的有效部分，调整溶液pH5.0，电导值5.OmS/cm，在lOku超滤膜上，21O下用0.O5mol/L乙酸缓冲液(pH5.0)进行透析。(11)阳离子交换层析。上样前，先用0.lmol/L乙酸缓冲液(pH5.0)平衡树脂。上样后。用相同缓冲液冲洗。在21O，采用盐浓度线性梯度55OmS/cm进行洗脱，配合SD茸PAGE收集干扰素峰。(12)浓缩。合并阳离子交换层忻洗脱的有效部分，在21O，用lOku超滤膜进行浓缩，浓缩到lL。 (13)凝胶过滤层析。上样前，先用含有0.l5mol/LNaCl的0.Olmo/L磷酸缓冲液 (pH7.0)清洗系统和树脂，上样后，在21O下，用相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分，最终蛋白浓度应为0.10.2/mL。(14)无菌过滤分装。用0.22m滤膜过滤干扰素溶液，分装后，于-2O 以下的冰箱中保存。整个分离和纯化工艺过程如4-2所示。原料沉淀离心疏水层析沉淀超虑超滤阴离子层析透析缓冲液配制菌体裂解沉淀离心盐析粗干扰素溶液冰箱保存离心透析阴离子层析超滤凝胶层析无菌分装入库压盖加塞图3-2 干扰素- a 2b提取纯化工艺流程图(15)检测项目。干扰素的检测项目有:干扰素鉴别试验，干扰素效价测定，蛋白质含量测定，电泳纯度测定，HPLC纯度测定。相对分子质量测定，宿主残余蛋白检查，宿主残余DNA检查，紫外光谱扫描图谱，肤图谱，N末端氨基酸序列分析，热原测定，细菌内毒素含量测定，IgG、残余抗生素检查等。二、干扰素纯化工艺过程控制蛋白质纯化的总目标是增加制品纯度或比活性，即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性 (以活性单位/mg蛋白表示)。设法除去变性蛋白质和杂蛋白质，并且希望所得蛋白质的产量和纯度达到最高值。在纯化的实际生产中，要考虑到另一个问题，即纯化的收率问题，这关系到蛋白质工业的经济效益以及某一套蛋白纯化技术的实用性。(1) 等电点沉淀。由于不同种类蛋白质的等电点不同，所以可将pH调到某种蛋白的等电点而使该蛋白沉淀下来。生产中即用这种方法去除一部分杂蛋白。蛋白质在等电点处仍然有相当的溶解度，故等电点沉淀不能完全将两种蛋白质分开，只能为层析等精密纯化手段减小压力，起到辅助作用。(2)膜分离。在基因工程产品的分离中，由于蛋白质的相对分子质量大多在l0000010000000之间。正好是超滤膜许可截留相对分于质量的范固。因此常用超滤技术进行分离、浓缩。超滤过程中会产生浓差极化现象，会降低滤过速率。在使用超滤膜时，选用切向流滤器会避免浓差极化现象的产生。选择合适的截留相对分子质量滤膜很重要。超滤膜的孔径是平均孔径。平均孔径不是膜孔径的上限。一般来说。超滤膜的标准截留相对分子质量是指截留率在90%或95%时对应的相对分子质量，而且不同种类的蛋白分子由于其空间形状不同，即使同一相对分子质量。截留率也不同。为了能将目标蛋白彻底截留下来，选择膜的截留相对分子质量垃是目标产物的1/21/3。使用超滤膜过滤目标蛋白质时。截留相对分子质量应该在目标蛋白质相对分子质量的10倍以上。在使用过程中，经常发现膜的截留率很高。但收率却很低。这主要是膜吸附作用造成的，所以应选择低吸附型的超滤膜。(3)疏水性层忻。在高电导的条件下上样层析，疏水性基团较多的目标蛋白质与配基相互作用而被吸附，缺乏疏水基团的蛋白质首先被洗脱流出。然后，再降低洗脱液的电导性，使蛋白质的疏水性降低。目标蛋白质就从树脂上被洗脱下来。疏水层忻的控制点是缓冲液和上样液的pH和电导值。pH关系到蛋白质的活性，同时也影响其疏水性。电导值决定了蛋白质表现出的疏水性强弱，即与树脂的结合能力。所以电导值的准确尤为重要。(4)离子交换层忻。标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。DEAE等阴离子树脂侧链电荷为正，可与带负电荷的蛋白结合;CM等阳离子树脂侧链电荷为员。可与带正电荷的蛋白结合。离子交换层析时，先用离子强度较