微生物的保存技术.doc

第14 章 微生物的保存技术工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中，用先进的DNA 重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此，世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）。微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30 年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。14.1 细菌的冻干保存法14.1.1 一般概念冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC 在1985 年第16版细菌、噬菌体和rDNA 载体目录册及1987 年第17 版真菌酵母目录册中，记载有11 000 株细菌、噬菌体和rDNA 载体及 21 000 株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna 等本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜170 遗传多样性研究的原理与方法1981；Jong 等 1987）。冻干法是长期保存细菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏体的标准方法（Franks 1985；Berny 等 1991；Smith1993；Day，Mclellan 1995）：将在理想条件下生长的健康的微生物细胞以相当高的浓度（106107 个细胞ml）分装在小灭菌瓶或安瓿内，迅速将这些小瓶在极低温度的液体溶剂内水浴或用仪器超低温冷冻（60），再用真空泵除去这些冷冻悬浮液中的水分，在真空状态下用空气喷灯熔解小瓶顶部的玻璃进行热封口，然后贮存于低于5的冰箱内。保存温度低（3 07 0）可以延长其活力。当微生物浓度较高时，生存率高，保存期也长。长期保存时，贮藏温度越低则越好。在冻干前一般要加冷冻保护剂，这样可使细胞免除在冷冻初期因形成冰晶而造成的损害。ATCC 常规用10脱脂奶或12蔗糖作为冷冻保护剂，而美国农业部（USDA）的农业研究服务机构的实验人员用牛或马血清作为微生物的冷冻保护剂（Halliday，Baker 1985）。在菌液中加入甘油和二甲亚砜（DMSO）也可防止冷冻中微生物的死亡，但实际操作中应根据不同微生物决定应用或不用防冻剂。冻干细胞的复苏很简单。只要在室温下打开安瓿，将少量液体营养培养基加入细胞中，再将重新水合的细胞转移到含有益于生长的培养基的容器内即可。用于冻干的实验设施成本为 2.5 万美元（Colwell 1986），但准备冻干培养物的实际花销不高。用冻干法保存的细胞其长期活力很好，这种方法也许是目前所使用的微生物保存法中效果较好和最经济的方法（Halliday，Baker 1985）。但有的微生物不适宜应用该技术，如病原微生物在冻干过程中往往由于细胞飞溅而发生污染或感染事故，所以，对于某些病原微生物还必须使用其他的贮存方法保存。14.1.2 材料（1）冷冻保护液（肌醇血清营养肉汤）：肌醇（Sigma，Poole，Dorset，UK） 6.67g营养肉汤粉（Unipath，Basingstoke，Hampshire，UK） 0.825g蒸馏水 33.3ml将上述物质置于一个250ml 的三角烧瓶内溶解和混合均匀后，用120高温灭菌15 分钟，冷却后在无菌条件下加灭菌马血清（Advanced Protein Product Ltd）100ml，混匀后，分装于 5ml小瓶内。分装好的小瓶在30下培养23 天，确定无菌后置30下保存，临用前解冻。（2）冷冻管：外径 16mm、长 36mm 的硼硅中性玻璃小管（Schubert Seals，N1595，Gosport，Hampshire，UK），使用前要经160灭菌2 小时。（3）塞子（Type 20133A，Schubert Seals），使用前要加热除去水分（单层放入不锈钢托盘中，置入110 热风干燥箱中加热2 小时）。（4）冻干仪（Edwards Freeze-dryer，Modulyo，Crawley，Sussex，UK）。（5）灭菌塑料加样头（Alpha Laboratories，Ltd，Eastleigh，Hamp-shire，UK）。（6）铝制封口盖。1413 方法（1）先用清洗剂（Flow Laboratories，Thame，Oxfordshire，UK，7 倍无磷实验室用清洗剂）清洗玻璃珠，然后用0 . 1 m o ld m 3 H C l 中和玻璃珠上的碱性，反复用自来水冲洗至珠子第14 章 微生物的保存技术 171的PH 值与自来水的pH 值相同为止，再用蒸馏水或去离子水清洗，最后置热风干燥箱内干燥。（2）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在理想的条件下培养（一般用有螺纹盖的20ml 管装的斜面培养基，将减少污染的机会）。（3）无菌条件下加 2ml 冷冻保护液到琼脂斜面内。（4）将细菌与保护液充分混匀，这时的细菌浓度为1081010 个细胞ml。（5）将混匀后的细菌悬液移入剩余的3ml 保护液内再次混匀（操作时要避免产生气溶胶，尤其是操作病原菌时）。（6）吸0.5ml 混匀液，加到预先标记好的冷冻管底部，操作时要特别小心，不要使液体漏到冷冻管外壁，以免造成污染。将塞子塞入冷冻管（但不要塞紧，以便在冷冻干燥仪中抽真空）。（7）将冷冻管放入金属半圆支架上，置入30冰箱内冷冻2 小时，同时将充填物（玻璃珠，2030 粒管）预冷至30，以免将盛有冷冻管的架子移入时冷冻管内的内容物解冻。（8）打开冻干仪的冷凝器开关，关闭冷凝器的排水阀。当冷凝器的温度降至50时，迅速将充填装置和冷冻管放入冻干室。然后关闭空气阀抽真空。20 分钟后要求真空室的压力到300Pa。要让冻干仪运行124 小时，以便样品完全干燥。（9）上述工作结束时，在真空条件下转动螺旋起重器，以终止运行。（10）用高频火花检测器（Edwards High Vacuum）检测冷凝管干燥器和放置期间是否维持真空环境。冷凝器内发浅蓝色或紫色光表示完全真空，深紫色或不发光表示非完全真空。（11）用铝盖密封冷冻管上的塞子。（12）小心移去铝盖和拔出塞子，使细菌复苏。（13）加约0.5ml 营养肉汤到冷冻管内，与冻干的细菌混匀，再将该肉汤接种到肉汤培养基中，并在理想的条件下培养。（14）移少量（0.1ml）解冻后的菌到营养琼脂板上，检测任何可能的污染。14.2 病毒的超低温保存法14.2.1 一般概念大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（ 如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1分钟）冷冻，直至150，再将这些小管贮存在150196的液氮中。超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10）、二甲亚砜（5）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。172 遗传多样性研究的原理与方法超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。14.2.2 材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。14.2.3 方法（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。14.3 低温保存法14.3.1 材料（1）培养基：2 号营养肉汤粉（Unipath） 2.5g甘油（Sigma） 15ml蒸馏水 85ml将上述材料混匀后，分装在5ml 瓶内，在121下灭菌15 分钟。（2）厌氧菌用 BGP 培养基其中不加琼脂，而加 15（体积比）甘油：胰蛋白胨（Unipath） 1.0g氯化钠 0.5g牛肉提取物 0.3g酵母提取物 0.5g盐酸半胱氨酸 0.04g葡萄糖 0.1g磷酸氢二钠 0.4g第14 章 微生物的保存技术 173甘油 15ml蒸馏水 85ml将上述材料混匀后，分装在 10ml 瓶内，在 121下消毒 15 分钟。以上两种培养基使用前均能在4环境中存放几个月。（ 3 ） 玻璃珠： 将直径为2mm 的玻璃珠（ Creative Beadcraft Ltd ； mersham ，Buckinghamshire，UK）按上述冻干法中的清洗法清洗。（4）冷冻管：在2ml 有盖冷冻管（Nunc，Paisley，Scotland）内存放2030 粒清洗好的玻璃珠，盖好盖后置121下消毒15 分钟。消毒过的冷冻管可在室温下保存。此外，将超低温冰箱预先冷却到70，灭菌塑料加样头。14.3.2 方法（1）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在适宜细菌生长的条件下培养细菌。（2）无菌条件下加2ml 细菌悬浮液至营养肉汤中。（3）用一支无菌的塑料环将细菌和肉汤混匀（细菌的最终浓度为1081010 个细胞ml）。（4）按冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管内，反复吹打几次，使珠子内部的气泡完全被细菌悬浮液所替代。（5）吸去冷冻管内多余的液体。（6）将混有细菌和珠子的冷冻管放在架子（Jencons Scientific Ltd，Leighton，Buzzard，Bedfordshire，UK）上，然后将架子放入70的冰柜内。（7）从冰柜中取出一支冷冻管，在无菌条件下打开，用灭菌镊子从管中取出一粒珠子，然后迅速将管子放回冰柜，以免管子内的其余珠子融解。（8）直接将珠子接种到固体培养基上或液体培养基中，在适当的条件下培养。14.4 传代培养保存法尽管与上述方法相比，用传代培养保存法保存微生物的时间较短，且会使微生物在反复传代和适应的过程中发生变异，但由于其简便易行，加之一些不耐冷冻和干燥处理的微生物还需要用该法保存，所以，传代培养保存法是所有使用微生物的单位都要采用的基本保存法。目前必须依靠传代培养保存的微生物仍为数众多。传代培养保存法主要是保存生活态的微生物，它又分为连续用培养基传代和连续用活宿主传代。斜面保存法和矿物油保存法是传代培养保存的两种最常用的方法。14.4.1 斜面保存法斜面保存法是传代培养保存法的具体方法，其优点是简便，易于推广。但用该法保存微生物的时间不太长。由于在具体操作时需要多次传代，加之斜面培养基中又保持了一定的营养条件，因此，用这种方法保存的微生物还易产生变异。使用该方法保存微生物时，可将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，培养至菌种充分生长后，放4冰箱中保存。每隔一定时间进行接种培养后再行保存，如此连续不断。一般细菌、酵母、放线菌和霉菌均可用此法保存。174 遗传多样性研究的原理与方法14.4.2 矿物油保存法矿物油保存法是传代培养保存法的变相方法，也较简单，且保存时间可达1 年以上。矿物油保存法，即是将接种在斜面培养基的细菌经过培养后，加入灭菌的石蜡油并浸盖住整个斜面（ 覆盖的深度为2cm ），使之与空气隔绝，以降低微生物的代谢率（ Gherna1981），再将浸盖有石蜡油的斜面培养菌种置于约4或室温保存即可。复苏的方法与常规再培养的方法类似。尽管这种方法可使保存的细菌3 年内不死，但不适于微生物的长期保存，因为每隔几年就必须复苏、鉴定和再贮存，从而耗费人力和物力。霉菌、酵母菌和放线菌可用该法保存，一些不适于冷冻干燥的微生物用该法保存也有效。14.5 砂