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利用微藻生产高附加值产品一、 利用裂壶藻（Schizochytrium）和寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）生产DHADHA的生理作用：1 促进神经系统和视觉系统的发育 DHA 是存在于人类乳汁中的一种多不饱和脂肪酸。研究表明，DHA 能促进婴幼儿的神经和视觉系统的发育（Nettleton，1993；Das，2003）；另外，在胎儿的大脑形成以及心血管系统的生成中也具有重要作用。而胎儿和婴幼儿合成的DHA远远不能满足大脑迅速发育的需要（Crawford，1987），必须从食物中得以补充。因此，母乳哺育和为孕妇和婴幼儿补充适量的DHA被提倡和鼓励。2 基本结构成分 DHA在大脑和视网膜组织的细胞膜中含量丰富。在视网膜的棒状外侧部分的细胞中，DHA可达细胞总脂的60%以上（Giusto，2000）；在人脑组织的细胞中，DHA占总脂的10%左右，因此是人体视觉和神经系统细胞膜的重要组成成分。3 防治心血管疾病 DHA可以抑制内源性胆固醇和甘油三酯的合成，增加脂蛋白脂酶的活性，促进周围组织对极低密度脂蛋白的清除，降低血清中甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白的含量，提高高密度脂蛋白的含量；同时, DHA还通过调节血小板和血管壁的前列腺素(PGs)的产生而发挥抗血栓作用。这些作用均能降低心血管疾病的发病率（Kang，1996；Nordoy，2001）。4 抗癌作用 DHA具有良好的免疫调节作用。研究表明，DHA能促进T淋巴细胞的增殖，提高细胞因子TNF-2、IL-1b和IL-6的转录，而这细胞因子表达的提高可以促进免疫系统的功能，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的杀伤力（马栋柱，2002）。另外，DHA结构中含有多个双键，是脂质过氧化的天然底物。脂质过氧化产生的活性氧能提高肿瘤细胞对治疗药物的敏感性（陈爱军，2002），产生的自由基和脂质过氧化物则可抑制肿瘤细胞的表达，缩短染色体的端粒，促进肿瘤细胞的凋亡（Das，2002 ）。5 抗炎作用 EPA和DHA 具有抗炎症的作用。机理如下：花生四烯酸（AA）通过环氧化酶可产生前列腺素（PGs），特别是PGE2，是炎症发生的介质。同时，AA还通过白细胞的5-脂氧化酶产生白三烯（LTs），如LTA4、LTB4等。其中LTB4具很强的白细胞趋化性，在炎症的发生中起重大作用；而LTC4和LTD4也通过增加血管的通透性参与炎症过程。而EPA可通过白细胞的5-脂氧化酶产生一类几乎无生理活性的物质LTA5、LTB5等，从而竞争抑制LTB4等的合成，同时，LTA5还可阻碍LTA4转化成LTB4。并且，EPA还可通过竞争性抑制作用使AA合成PGE2减少，降低急性炎症的严重性，因而具有抗炎作用（Gill，1997）。DHA是哺乳动物生物合成PGs的强烈抑制剂，也具有抗炎作用（James，2000）。 另外，DHA是许多鱼、虾、贝类幼体所必需的脂肪酸，因此可作为水产养殖饵料的添加剂。研究表明，饵料中添加一定比例的DHA，可显著提高海水鱼、虾及贝类幼仔的成活率和生长速率（Reitan, 1994; Giusto，2002；Copeman，2002）。另外，DHA还影响色素的形成和沉淀，因而在防止白化方面也有重要作用（Copeman，2002）。水产饵料中DHA含量的高低已成为评价该种饵料营养价值高低的重要指标。目前，市场上供应的来自鱼油的DHA和EPA制品中的70%被用作水产养殖饵料的添加剂（Sijtsma，2004）。 正是由于n-3 PUFAs对人体健康具有诸多生理功能，一些国家和科研机构已明文建议人们提高膳食中n-3 PUFAs的比例，成人每天最好能摄入1.0-1.5g的n-3 PUFAs。国际上对n-3 PUFAs保健食品和药品的研制与开发十分重视。1991年日本批准DHA作为高血脂症的临床用药。目前，国外市场上销售的DHA和EPA产品已有几十种，涉及奶粉、饮料、面包类以及水产养殖业的饵料等，商业价值巨大。裂壶藻介绍裂壶藻（Schizochytrium）目前已有五个种被分离出，分别是：S.aggregatum、S.minutum、S.octosporum、S.mangrovei和S.limacinum。其中，S.limacinum从西太平洋沿岸的红树林地区分离得到，单细胞，球形（见图1-5、图1-6），细胞内积累了大量的油脂，总脂肪酸中不饱和脂肪酸含量很高，主要为n-3 PUFA DHA，另外一种n-6 PUFA的含量也较高，而其它的不饱和脂肪酸含量甚微；且细胞中90% 以上的油脂以人体易吸收的中性油脂甘油三脂（TG）的形式存在。因此，是一种理想的DHA的新生资源。图1-5 光学显微镜下S.limacinumOUC88的形态 Fig.1-5 Picture of S.limacinum OUC88 under light microscope图1-6 电子显微镜下S.limacinum OUC88的形态1. 细胞壁; 2. 脂肪颗粒Fig.1-6 Picture of S.limacinum OUC88 under electronic microscope Fig.61. cell wall; 2. lipid drops寇氏隐甲藻介绍： 隐甲藻（C.cohnii）是一种海生、无色、异养双鞭毛甲藻，多生长在腐败的大型褐藻上，也可在琼脂板上生长，属于从原核生物向真核生物的过度类型。它是由Javornicky于1962年首次在Seligo海边采集得到的，其分类地位是隐甲藻门、甲藻纲、多甲藻目、隐甲藻科、隐甲藻属。 目前对隐甲藻产DHA的研究主要集中在高产藻种的筛选及其发酵条件的优化上。日本川崎公司上原健一等筛选了ATCC（American Type Culture Collection）保存的C.cohnii的多个藻种，结果ATCC30021的DHA含量最高，通过培养基组成的优化，DHA的产量达到1.75g/L。华南理工大学食品与生物工程学院姜悦与王菊芳博士对C.cohnii ATCC30556进行了研究，优化培养基和发酵条件后藻细胞的生物量和DHA产量分别达到10.78g/L和1.205g/L。Swaaf等利用乙醇为碳源对C.cohnii ATCC30772进行分批补料培养220h后，藻细胞的生物量、总脂及DHA产量分别达到85g/L、35g/L和11.7g/L，是目前关于隐甲藻报道的最高DHA产量。 不同的培养条件对C.cohnii细胞生长和DHA含量都有一定的影响。温度会影响隐甲藻细胞的分裂方式，当温度在20-30时，细胞以二分裂的方式繁殖，当温度在30-34之间时，有30%-40%的细胞是以四分裂的方式繁殖。 姜悦在1530范围内培养C.cohnii ATCC30556，发现高温有利于细胞比生长速率的提高，但低温有利于DHA的大量积累，采用变温的方式进行培养隐甲藻，有利于提高不饱和脂肪酸的产量。pH也是影响C.cohnii生长和产物积累的重要因素，当pH为6.007.14时有利于DHA的积累。C.cohnii是一种耗氧微生物，它的生长和不饱和脂肪酸的积累都需要氧气。Kyle等的研究指出，培养过程中应保持溶氧不低于30%，低的溶氧会使细胞生物量和不饱和脂肪酸产量下降。Silva等在C.cohnii的培养基中加入n-dodecane作为氧载体进行分批补料发酵时，86.7h以后隐甲藻生物量、总脂含量及DHA产量均开始超过不加n-dodecane时的值，在培养137.2h后DHA产量达到最大值9.75mg/L*h，此时DHA占总脂含量的51%，占生物量的6.14%。 培养基的组成对C.cohnii细胞生物量和DHA产量也有重要的影响。C.cohnii可以利用多种碳源，如葡萄糖、醋酸钠、甘油等，但更能较好地利用葡萄糖。有机氮源有利于C.cohniiATCC30556的生长，无机氮源有利于DHA的积累。Swaaf等指出，随着NaCl浓度的升高，C.cohnii ATCC30172细胞生物量和油脂含量增加，当NaCl浓度为17.8g/L时，细胞的油脂产量最大。另外，微量元素、维生素等都对C.cohnii的DHA积累也有很大影响。 在工业生产中，细胞的高密度培养是非常重要的。Swaaf等研究发现，在培养C.cohnii ATCC30772五天后，细胞进入稳定期，培养液的黏度增大，溶氧下降，经过分离纯化后，发现细胞产一种多糖分子，其分子量大小不一，从6Kda到1660Kda，并且以单体的形式分布，经过分析，发现大分子量的多糖是由71.7%的葡萄糖、13.1%半乳糖、3.8%甘露糖组成；中等分子量的多糖是由37.7%的葡萄糖、19.8%的半乳糖、28.1%甘露糖；其它的单体分子组成包括果糖、糖醛酸和木糖，它们主要是通过-1，3糖苷键连接。C.cohnii在后期产多糖是影响细胞高密度发酵的重要因素。David等用同位素标记的醋酸盐培养C.cohnii，对其脂肪酸代谢途径进行了研究，结果发现细胞内存在两条脂肪酸碳链的延长途径，一是以C18为终产物，可利用外源添加的脂肪酸进行碳链的延长；另一条是以C22为终产物的途径，该途径不能利用外源脂肪酸进行碳链的延长。Swaaf等在C.cohnii的培养基中分别加入13C同位素标记的醋酸盐、丁酸盐、油酸，利用核磁共振分析其合成的DHA中的同位素标记，结果在加入醋酸盐和丁酸盐培养时合成的DHA中检测到所标记的碳，加入油酸的则没有。王永华对C.cohnii细胞内脂肪酸的积累和酶活性的变化相关性进行了初步研究，通过比较三种碳源培养条件下藻细胞合成不同脂肪酸的能力推测：在脂肪酸合成途径中，C18:1到C18:2可能是DHA合成中的限速步骤。另外发现苹果酸酶在脂肪酸合成、碳链延长和脱饱和过程中起着非常重要的作用。 目前美国Martek公司以隐甲藻C.cohnii作为DHA的生产藻种，利用其己建成的150m3规模的工业化异养培养设备，生产纯度较高的DHA和富含DHA的微藻饲料及食品添加剂。卫生部网站3月15日消息，根据中华人民共和国食品安全法和新资源食品管理办法的规定，卫生部批准裂壶藻（Schizochytrium sp.）、吾肯氏壶藻（Ulkenia amoeboida）和寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）为生产DHA藻油的新资源食品，并推荐食用量300毫克/天（以纯DHA计）。表1-5 卫生部公布的关于DHA藻油新资源食品中文名称DHA藻油英文名称DHA Algal Oil主要成分二十二碳六烯酸 (DHA)基本信息来源：裂壶藻（Schizochytrium sp.） 吾肯氏壶藻（Ulkenia amoeboida） 寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）生产工艺简述以裂壶藻(或吾肯氏壶藻或寇氏隐甲藻)种为原料，通过发酵、分离、提纯等工艺生产DHA。推荐食用量300毫克/天（以纯DHA计）质量要求性状淡黄色到橙色油状液体DHA含量35g/100g反式脂肪酸1水分及可挥发物0.05%其他情况说明在婴幼儿食品中使用应符合相关标准的要求二、 利用微拟球藻(Nannochloropisis salina)和三角褐指藻(P. tricornulum)生产EPAEPA生理作用： 1、抑制血小板凝集,减少血栓的形成 AA能生物合成PGI2和TXA2,它们对血液凝固有完全相反的作用。TXA2有促使血小板凝集、收缩血管、升高血压的作用; PGI2在血管壁内合成,有强烈的松驰血管、降低血压的作用。一般说来,二者之间有很好的平衡。但在某些病理条件下,如血管壁破损、或随年龄的增长血管组织老化,PGI2合成减少,就可能导致血栓的形成。EPA代谢生成的TXA3几乎不具有促血小板凝集作用, PGI3则有力地控制并抑制血小板在血管壁的凝集。因此当增加食物中EPA的含量,EPA就能与AA在血小板、血管壁细胞膜磷脂中竞争性地和脂氧酶、环氧酶作用,抑制AA的代谢,减少TXA2生成,但不抑制PGI2的生成。这样, PGI3与PGI2就能有效地控制并抑制血小板在血管壁的凝集,降低血液粘度以及细胞聚集指数和刚性指数,改善血液流变性,从而降低血栓的形成。另一方面,EPA还能促进环腺苷酸(cAMP)合成,降低钙离子浓度,稳定血小板功能,减少血小板内促聚物质的释放。增加血小板膜的流动性,使血小板自身及外环境改善,从而改变血小板对刺激的反应性及血小板表面受体数目。DHA不是PGS合成酶的底物,但能与环氧化酶结合,因而也是PGS的抑制剂,也可以减少如PGI2和TXA2等衍生物的产生。 2、降血脂、预防和治疗动脉粥样硬化 动脉粥样硬化(AS)是中老年人的常见病和多发病,也是世界上死亡率最高的疾病之一。高血脂是致病的重要因素。大量的实验表明:富含EPA和DHA的鱼油能有效地降低血液中的中性脂质、总胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白。一般认为是通过以下机理进行的: 降低中性脂质的机理可能是通过两种机制进行。一是抑制甘油三酯在肝脏中的合成;二是抑制甘油三酯的浆脂蛋白的合成和释放。前者可能是主要作用机制。减少体内胆固醇的合成是因为EPA在体内能转变成PGS, PG通过cAMP-蛋白激酶系统使胆固醇合成的限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMGCoA)还原酶磷酸化而丧失活性;同时抑制脂肪动员,故使内源性胆固醇合成减少。另外,EPA和DHA被消化吸收后,与肝脏分泌的载脂蛋白结合成高密度脂蛋白(HDL),与磷脂质结合的多不饱和脂肪酸由于卵磷酯-胆固醇酰转换酶的作用,使接近HDL表面存在的游离胆固醇被脂化,移至脂蛋白的内部,这样HDL从末梢组织夺取了多余的胆固醇,HDL作为受体与胆固醇结合形成HDL-C,而后通过血液循环送入肝细胞中,胆固醇形成胆汁酸排出体外而被消除。DHA降胆固醇的作用较EPA强。3、抑制肿瘤生长流行病学调查发现,以海产物为主食的爱斯基摩妇女,因患乳腺癌而死亡的人非常少。成泽富雄报道:鱼油中DHA和EPA均具有抑制直肠癌的作用,而且DHA的抑制效果更强。Dustin等发现DHA能抑制巨噬细胞的激活及具有杀伤肿瘤细胞的活性。DHA还可降低治疗胃癌、膀胱癌、子宫癌等抗肿瘤药物的耐药性,并且高纯度DHA可抑制大肠粘膜上产生异常腺窝及抑制异常腺窝的生长。动物实验表明,饱和脂肪酸可刺激癌症发生的起始阶段,而多不饱和脂肪酸以计量相关的方式作用于促癌生成期,在浓度为2. 0mg/ml时,DHA和EPA都能使PC-3细胞生长减少65%。4、抗炎、抑制过敏反应爱斯基摩人患喘息性气管炎、风湿性关节炎、红斑狼疮等以自身免疫异常为原因的慢性炎症性疾病的发病率明显低于当地的白种人。大量从海鱼、海兽中摄取EPA、DHA无疑是一个重要的原因。同时实验发现,饲喂EPA的动物,其实验性炎症的水肿程度降低。其机制包括16:-3多不饱和脂肪酸(EPA、DHA)能置换细胞膜磷脂中的花生四烯酸,竞争环氧酶和脂氧合酶从而减少来源于AA的炎性介质,减轻炎症反应:-3多不饱和脂肪酸也可通过改变细胞膜磷脂脂肪酸构成来影响细胞膜流动性,膜上相关信号分子、酶、受体的功能,从而改变信号传导过程。此外,通过影响酶或细胞因子的基因表达、抑制促炎症因子产生、调节黏附分子表达来调节免疫功能,这种机制可不依赖类二十烷酸物质的产生。三角褐指藻简介三角褐指藻归于硅藻门(Bacillariophyta)、硅藻纲(Bacillariophyceae)、舟形藻目(Naviculales)、褐指藻科(Phaeodactylaceae)、褐指藻属(Phaeodactylum)。三角褐指藻有卵形、梭形和三出放射形3种不同的形态，在不同环境条件下可以转变。正常液体培养时，常见的是三出放射形和少量梭形细胞，这两种形态都没有硅质细胞壁。三出放射形细胞长度约为10-18m(两臂间垂直距离)，有3个“臂”，长度为6-8m。细胞中央有一细胞核，黄褐色色素体1-3片。梭形细胞长20m左右，卵形细胞长8m左右，宽3m，有一个硅质壳面，缺少另一个壳面，也没有壳环带。梭形细胞主要行纵裂繁殖。硅藻纲中 C14:0、C16:0、C16:1 n-7和C20:5 n-3是其主要特征脂肪酸，占总脂肪酸的67-70%左右，其中三角褐指藻EPA含量较高，几乎不含有或仅含有微量的DHA和C20:0。微拟球藻简介微拟球藻属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)，微拟球藻属。细胞球形，单独或聚集。色素体一个，淡绿色，侧生。眼点淡橘红色，在生长良好的情况下，色素体很深，不容易观察到眼点。没有蛋白核。淀粉粒13个。细胞壁极薄，细胞分裂时细胞壁与细胞之间形成空隙。脂肪酸组成相对简单，C16:0、C16:1 n-7和C20:5 n-3构成其主要脂肪酸，占总脂肪酸的比例可达74.8 。该种类微藻脂肪酸组成和绿藻的主要区别在于含有较高的EPA，而缺乏C16和Cl8的PUFAs。三、利用紫球藻（Porphyridum cruentum）生产花生四烯酸（AA）和紫球藻多糖花生四烯酸的生理功能 花生四烯酸对婴幼儿大脑和视网膜功能的完善具有重要意义，这是花生四烯酸早已被发现的生理功能，之后的研究中，花生四烯酸新的生理功能相继被发现。花生四烯酸（C204）是类二十烷酸的前体，类二十烷酸是很多生化过程的重要调节剂，在协调细胞间生理学的相互作用中具有重要意义。许多必需脂肪酸缺乏的体征可能是由于类二十烷酸化合物的代谢改变而引起，例如影响生长和生殖的问题可能与类二十烷酸在下丘脑与脑垂体激素释放中的作用和促进甲状腺分泌甲状腺素的反应有关。由花生四烯酸衍生的类二十烷酸最为重要，在多种膜磷脂中花生四烯酸皆高于其他二十碳的脂肪酸，而且环氧化酶对花生四烯酸的特异性也较强。 这些脂氧合产物为炎性过程和免疫调节作用的介质。前列腺素（PG）主要由花生四烯酸合成。前列腺素是一组比较复杂的化合物，广泛存在于各组织中，是脂类成员中最有生理活性的一类物质。 由花生四烯酸产生的另一重要活性物质为白三烯（LT），其主要功能有：促进白细胞的凝集、附着、趋化以及释放涪酶体内的酶。C型白三烯能促进血浆从毛细血管后小静脉渗出。白细胞趋化和血浆渗出是炎症的两个主要特征，类风湿性关节炎患者的膝关节滑液内，LTB4浓度高，表明白三烯在炎症发生过程中具有重要作用。白三烯对冠状动脉有收缩作用。白三烯能引起支气管收缩，使吸气阻力增加。 总之，这些花生四烯酸的衍生物具有多种生理作用，在人体各种机能中都具有重要的作用。此外，花生四烯酸在正常大脑功能中亦具有重要作用。花生四烯酸及其代谢产物对神经细胞的影响包括调整神经元的跨膜信号、调节神经递质的释放，以及葡萄糖的摄取，都是不可缺少的。对基因表达的影响及与一些慢性病的关系尚在进一步的研究。紫球藻多糖的主要应用1胶体稳定剂紫球藻多糖具有独特的胶体性能，被作为胶体稳定剂（粘和剂、乳化剂、增稠剂等）广泛应用与食品、医药、化妆、纺织、印染、冶金石油等行业。在食品工业中可作为凝固剂和糖一起制成软糖，和淀粉一起制成包糖用的糯米纸。制面包时加入多糖琼脂可以使面包保持长期松软。也可用于挂面、冰糕、果汁、冰激淋中作为增稠剂。制鱼肉罐头时加入多糖琼胶，可以保持鱼肉的原形，不致在运输中散开。在国外，还用琼胶作为酿造酒、醋、酱油的澄清剂。在石油工业中，国外已成功地将其用作增稠剂，用于从地下沙质形成物中回收石油。在医药行业，可作为药膏的药基，包药粉的药衣和细菌培养基的凝固剂。其良好的乳化性能可做化妆品的保湿。2抗病毒紫球藻多糖中硫酸酯基团具有治病抗病的活性。Fabregas J等用败血症病毒（VHSV）、非洲猪热病毒（ASFV）这两种封闭病毒作为病毒模型进行研究，结果表明：从P.cruentum中提取的水溶物（主要有效成分为硫酸酯多糖）对两种病毒的体外复制有明显的剂量依赖性阻断作用。Garcia-Villalon D等进一步研究了硫酸酯多糖抗ASFV的机理，对放射标记的ASF病毒体的研究表明，硫酸酯多糖阻止了病毒的吸附作用，但仅当多糖出现在病毒体的吸附过程中时，才对病毒复制有阻遏作用。另有报道，这种多糖对植物病毒、动物疱疹病毒有较强的抗性。可以预见，紫球藻多糖可预防鱼和哺乳动物病毒的致病作用。3降血脂、降胆固醇ArielGiuzberg等报道，用紫球藻粉喂养小鸡，结果其血中胆固醇水平降低，卵黄中脂肪酸的构成也发生了改变。Irit-Dvir等研究了紫球藻多糖和藻粉对雄性Sprager-Daw-ley鼠脂代谢方面的影响：实验组血清胆固醇水平均显著低于对照组（22%117%），多糖还降低了粘膜胆固醇浓度，胆酸排泄量也有显著提高。结果还显示，藻多糖和藻粉即使在较低的浓度水平下也有潜在的降低血胆固醇活性，说明该多糖能影响动物的脂类代谢。其影响脂代谢的机理目前有几种学说，有待进一步的研究。但从目前研究的结果来看，紫球藻多糖可作为一种功能保健食品，降低血脂，预防和治疗心血管疾病及肝、胆、胰疾病。4抗肿瘤活性许多调查说明，胃肠道肿瘤和内分泌器官肿瘤，特别是乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的发病率和死亡率与脂肪有直接关系。Irit-Dvir等的研究显示，P.sp.影响了雄Sprager-Dawley鼠的胃肠生理：藻多糖显著增加了小肠和结肠的长度，增厚了空肠粘膜和肌层。紫球藻中的PUFA可以调节脂代谢，使鼠胆固醇水平显著降低，胆酸排泌量增加。因此，紫球藻多糖可以有效的减少结肠癌等胃肠道肿瘤的发病风险。在医药和保健品领域具有潜在应用价值。5对重金属的吸附作用Palamarullana等报道，微藻可以生物收集放射性离子Zn65+实验中用P.cruentum等来净化含放射性离子Zn65+的污染水体。在藻胶体与放射性悬液接触后15分钟内，Zn65+就被完全化学吸附，滞留于藻胶中。CecalA等报道，用微生物收集体回收释放的的双氧轴离子UO22+，P.cruentum可收集14.22%91.99%的UO22+。尽管这项技术目前多用于处理工业污水，但相信随着研究的深入，可以应用于清除人体内富积的重金属离子及机体产生的自由基，抗氧化抗衰老，保持人体健康。紫球藻作为一种绿色保健药物，前景诱人。紫球藻简介 紫球藻属于红藻门(Rhodophyta)、原红藻纲(Protoflorideophyceae)、紫球藻目(porphyridiales)、紫球藻科、紫球藻属，是1849年首次发现的一种比较原始的单细胞红藻。它分布于海水，淡水，咸水及潮湿的土地中，有较强的抗盐性，能在含盐量高达3.5一4.6%的环下正常生长。紫球藻含有占生物总量约9.5%的脂肪酸，各种高不饱和脂肪酸(PUAF)占总脂肪酸的50%以上，其中又以花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸为主。研究表明微藻中脂肪酸的组成成分及含量受藻体生长时的营养盐和多种环境因素的影响，光密度、盐度、含氮培养基的日更新比例等都会影响到脂肪酸的成分含量。因此，人为地控制紫球藻的生长条件可以定向、高效地生产某一类PUAF，如在适宜的生长条件下紫球藻中花生四烯酸(AA)含量可占总脂类的36%，其生产速度在温度32、光强8000lx条件下可达.046mg/h*L，或者可合成占总脂肪量44%的EPA。可见，通过人为地控制紫球藻的生长条件，定向高效地生产某一类具有较高药用和保健价值的PUAF尤其是AA和EPA，是一条非常有效的途径。另外，紫球藻多糖主要由木糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成，其中硫酸酯是治疗抗病的活性基团。该多糖因有SO42-和COO-的存在而呈电负性，具有独特的胶体性能。Geresh S等研究了此多糖的流变学：其水溶液在广泛的pH和温度范围（pH112，2090）下都很稳定，钠钙离子对其影响较小，可与单价阳离子共存。紫球藻培养液通过离心，上清液经过醇沉淀即得到所需的胞外多糖粗品。Geresh S将溶解的多糖用十六烷基氧化吡啶沉淀，将多糖转化为钙盐，再用乙醇沉淀，生产出了光学纯产物，其中含7.6%的硫酸盐组分。王长海等研究了紫球藻合成的多糖分布及含量，紫球藻合成的多糖在细胞内外均有分布，但主要分布在细胞外。紫球藻多糖由高尔基体合成并分泌到细胞外，多糖的产量与质量受很多因素的影响。硝酸盐（氮源）是主要影响因子，Fabregas Jaime等研究发现：氮不仅影响多糖的产量，还影响多糖在可溶性分泌多糖与固定的细胞外层多糖之间的比例。培养基中的一些离子也有影响作用：SO42-能促进多糖的合成；增加Mg2+浓度，在提高多糖浓度的同时却降低了多糖产量；Mn的加入不影响生长，但却明显地降低粘度。在适宜的条件下，紫球藻多糖产量可达到生物量的50%左右。四、利用杜氏盐藻（Dunaliella salina）生产-胡萝卜素-胡萝卜素生理作用 -胡萝卜素是一种橙黄色色素，广泛存在于植物中，是类胡萝卜素的一种，其化学组成为碳氢化合物，极易被氧化。组织学研究表明，-胡萝卜素有很强的抑制肿瘤转化作用；动物试验也表明，饲料中加入-胡萝卜素可明显减少紫外光和化学肿瘤促进剂，如二甲基苯叉蒽（DMDM）和1，2-二甲基肼（DMH）诱发的癌变。胡萝卜素对多种移植肿瘤也有抑制作用；在肿瘤的治疗和化疗过程中，-胡萝卜素可降低毒害作用，增强治疗效果。-胡萝卜素分子中含有多个共轭双键而成为一种良好的抗氧化剂。它可提高机体的解毒功能，抑制致癌物质的活性。-胡萝卜素具有抗癌功效的机理之一是它可提高宿主的免疫功能。实验证明，-胡萝卜素可促进吞噬细胞和淋巴细胞的功能，并可促进细胞释放一些抗肿瘤因子。-胡萝卜素对眼睛白内障和黄斑变性病以及心血管病也有一定的防护作用37。最新的研究表明，-胡萝卜素对人体有抗震扰作用。 -胡萝卜素是高活性的维生素A的前体，自然界中所有的维生素A都来源于类胡萝卜素，-胡萝卜素进入人体被吸收后一部分转化为维生素A，可补充和治疗维生素A缺乏症，如夜盲症，在第三世界国家中，维生素A缺乏症是一种非常严重的营养缺陷性疾病。-胡萝卜素转化的另一部具有猝灭人体有害自由基的作用，可保护机体免受辐射损伤、延缓机体衰老及防癌、抗癌，并对人体无任何毒副作用，可增强机体免疫力，被公认为第一位的抗癌维生素。在组织学中，-胡萝卜素有很强的抑制肿瘤转化作用。-胡萝卜素还可保护生物细胞免受光、空气、和敏化色素的有害影响。临床实验证明，添加-胡萝卜素可成功治疗遗传性光敏疾病。此外，-胡萝卜素对眼睛白内障和黄斑变性病以及心血管疾病也有一定防治作用。况且近年来的研究发现人工合成的一些食用色素不止在功效上不如天然色素，而且可能对人体有害，甚至有致癌致畸作用，因此合成色素的使用受到限制。而且研究表明天然-胡萝卜素比人工合成的-胡萝卜素有更强的抗氧化和淬灭自由基能力 ，原因是微藻产生的-胡萝卜素中9顺式的结构比例要比人工合成的高得多，天然-胡萝卜素具有更好的疗效和保健功能，比人工合成的价格高得多。除此之外天然-胡萝卜素作为食品、着色两用的食品添加剂，是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合委员认可的无毒有营养的食品添加剂，目前已有52个国家和地区批准使用。国际上，在口红胭脂等化妆品中添加，可使其色泽自然丰满，又能营养保护皮肤，受到热烈欢迎。因此以生产-胡萝卜素为目的的杜氏藻藻培养在国际上受到了很大重视。 杜氏盐藻简介：杜氏藻(Dunaliella)又称盐藻，是一种单细胞真核藻类，分类上现在归为绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorphyceae)、团藻目(Volvocales)、盐藻科(Dunaliellaceae) 、杜氏藻属(Dunaliella Teodoresco)。杜氏藻属的细胞形状和构造与衣藻（Chlamydomonas）属很接近 , 但没有细胞壁，细胞长2.840m , 宽1.520m ，其原生质膜外有一层薄而富有弹性的黏液状细胞外膜，由糖蛋白和神经氨酸组成，是天然的原生质体。不同种类或同一种类的细胞形状和结构在不同的生活条件下会有很大的变化，细胞随生长环境的变化而发生改变，通常为梨形、纺锤形或椭圆形等变化不一，在不适的环境中通常会变成球形。杜氏藻细胞的顶端有两根等长鞭毛，比藻体略长，杜氏藻可以自由游动（图1）。杜氏藻细胞中有一个杯状的占了细胞大部分体积的叶绿体，在海生和高盐种类中在叶绿体基部的中央有一个储藏淀粉的淀粉核，在有些种如D.salina的淀粉核的周围还有含一胡萝卜素的脂性小颗粒，这样的细胞将呈现红色。藻体前端有一红色大眼点，处在叶绿体前端的圆周上，具有向光性。细胞核位于细胞的前部，通常为叶绿体的前叶所包围，具有双层核膜，细胞核内具有典型的核仁。D.salina细胞长2024m，宽1014m，在一定胁迫条件下盐生杜氏藻藻细胞中能合成并积累大量的甘油、-胡萝卜素。盐生杜氏藻中-胡萝卜素含量最高可达干重的 14 %, 远远高于其它动物和植物体内的含量 , 是-胡萝卜素的极好天然产源。图1 杜氏藻Fig.1 Dunaliella杜氏藻耐受能力很强，自然界中分布极广，不仅分布于全球各种化学类型的盐水和海水中 , 在淡水和潮湿土壤中也有存在。除了对盐浓度的广适性外，杜氏藻属的所有种还能适应许多其它方面的逆境，如大范围的温度变化，高静水压等，D.tertiolecta还能够忍受某些杀虫剂，对于铜、汞、铝等重金属离子也具有较强的抗性。除此之外，杜氏藻对于酸碱也有极强的适应能力，它可以在pH从0.3(D.acidophlia)到大于11(D.salina)的环境中生长。在普通自然水体藻类区系组成中，杜氏藻数量很少，而在高盐水体中因为其耐受能力强，常常成为优势种群，并可形成绿色或红色水华，因此，杜氏藻常常是世界高盐湖泊和盐场蒸发池中主要的第一生产者，是耐盐性最强的单细胞藻类之一。盐生杜氏藻（D.Salina）在2%一39%盐度的盐水中均可存活，但低于0.2%的盐度则细胞破裂死亡。它的最佳繁殖盐度为12%，最佳生长-胡萝卜素度为15%。杜氏藻属大多数种类除了生活的盐幅极宽外，还可忍受很大范围的盐度突变。杜氏藻(Dunaliella)在特定的胁迫条件下可大量积累-胡萝卜素，其含量可高达干重的10%，甚至14%，为自然界所有生物之首。因此，早在1966年，Massyuk就提出可大规模培养杜氏藻用以提取-胡萝卜素。另外，杜氏藻可以在高盐的极端环境下生长，较易控制其它藻类和原生动物造成的污染，可进行大规模的室外培养。目前已有澳大利亚、以色列、美国、中国等国的十余家公司从事杜氏藻的研究开发(见表4）。-胡萝卜素越来越多的医疗功能正在被发现，国内和国际市场对杜氏藻产品的需求也在不断扩大。目前国内-胡萝卜素的市场价格为合成的1.1万元/公斤左右，天然的1.8万元/公斤左右。国际上天然-胡萝卜素的价格也是合成的二倍左右，但天然-胡萝卜素只占-胡萝卜素总产量的56%。国内对-胡萝卜素的年需求量约900吨，全世界年需求量在2500吨，年销售额为56亿美元（2003年），且每年以710%的速度递增，因此养殖杜氏藻生产-胡萝卜素产业发展空间极大。杜氏藻非常适合于大规模培养，其在高盐度下旺盛生长的能力，使其在室外进行培养时可保持相对的纯培养，几乎没有捕食者侵入。那些靠近盐湖或海边的具有强烈光辐射的干旱、沙漠地区可作为杜氏藻培养的场地，有利于-胡萝卜素的积累。目前中国的杜氏藻养殖主要集中在内蒙、天津、甘肃等地。五、利用杜氏盐藻突变株生产玉米黄素玉米黄素的生理功能 玉米黄素(Zeaxanthin)和叶黄素(Lutein)属于叶黄素类，均为带有羟基的类胡萝卜素，玉米黄素为3，3-二羟基-胡萝卜素，分子式为C40H56O2，。玉米黄素是一种新型的油溶性天然色素，不溶于水，可溶于有机溶剂，它是-胡萝卜素的衍生物，但在体内不能转化为VA,没有VA活性。在自然界中,玉米黄素的分布是非常广泛的，黄玉米、枸杞、甘蓝、菠菜、芥菜、金盏花、万寿菊花瓣等都含有大量的玉米黄素及玉米黄素，是玉米黄素的良好来源。另外,表1-1列出了一些水果和蔬菜中所含的主要的类胡萝素的含量。1.玉米黄素与视觉保护1.1玉米黄素与白内障玉米黄素和黄体素是眼睛晶状体中发现的仅有的类胡萝卜素。有研究认为，抗氧化维生素、类胡萝卜素(玉米黄素和黄体素)和自由基清除剂具有抗白内障的作用，一些营养素的摄入与白内障的形成存在负相关，其中类胡萝卜素与白内障危险性降低的相关性最强。1994年至2001年间美国国家眼科研究所(National Eye Institute,NEI)的一些眼部健康研究结果表明，摄入较高量玉米黄素和黄体素的人群患白内障的危险较低。最近的流行病学调查也表明.增加玉米黄素和黄体素的膳食摄入量有显著降低白内障摘除手术风险的趋向，在每天平均摄入6.0mg玉米黄素和黄体素的四分之一人群中，患白内障的风险降低达到了显著水平。1.2玉米黄素与老年黄斑变性1985年，Bone二等首次证明人体视网膜黄斑色素为玉米黄素和黄体素的混合物，并于1988年进一步研究了人体视网膜中玉米黄素和黄体素的分布，发现玉米黄素和黄体素分布于整个视网膜和晶状体中。1993年，Bone等对人体黄斑色素进行了完整的定性，并确定了它们的空间化学结构。1992年至1995年的一些流行病学的研究发现，血液中的抗氧化剂的浓度与老年黄斑变性的发病率呈反比，血液类胡萝卜素和抗氧化维生素浓度低的人患ARMD的危险较大。在众多的抗氧化剂中，类胡萝卜素的影响最大，特别是玉米黄素和黄体素，因为它们是视网膜黄斑区存在的主要类胡萝卜素。随着年龄的增长。黄斑区色素的浓度降低，若有黄斑变性的，黄斑区色素的浓度则更低些。1994年，Seddon等的研究认为，增加富含玉米黄素和黄体素的水果和蔬菜的摄入量，可减小患ARMD的危险，每日摄入含黄体素约6mg的果蔬，可使湿性ARMD的患病率降低43%。营养及流行病学的研究也表明，膳食或血液中高类胡萝卜素浓度尤其是高玉米黄素和黄体素浓度，与白内障和老年黄斑变性的发病危险成反比。对ARMD的最新研究己发现，ARMD的病因明确地与玉米黄素和黄体素有关。美国NEI的研究表明，摄入富含类胡萝卜素的食物特别是绿色食叶类蔬菜如羽衣甘蓝、菠菜等可降低患ARMD的危险，并批准黄体素作为食品补充剂用于食品饮料中。1.3玉米黄素与癌症的预防1981年，Peto等首次报道了类胡萝卜素可能在减少人类癌症的发生方面起作用。此后，大量流行病学的研究表明:一种或多种果蔬类胡萝卜素可降低一些主要慢性病如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等的发病率，摄入富含类胡萝卜素的食物、保持较高的血液类胡萝卜素水平，可降低癌症、心血管疾病和其它老化性疾病的可能性。Snodderly和Chew分别在1995年和1996年提出，玉米黄素在减少癌症的发生、发展、增强免疫功能方面有独特的生物功能。他们发现，喂养高玉米黄素含量的食物后，小鼠体内乳腺癌细胞的生长减慢，同时增强了淋巴细胞的增殖效应。细胞培养的研究结果表明，玉米黄素和黄体素在抑制细胞脂质的自动氧化和防止氧化带来的细胞损伤方面比-胡萝卜素更有效，而细胞脂质的过氧化可能与肿瘤的生长有关。一些研究表明，玉米黄素是乳腺癌抗癌剂，玉米黄素和黄体素的摄入量与前期乳腺癌的发病率成反比。1.4玉米黄素与心血管疾病的预防心血管疾病是目前死亡率较高的疾病，病因十分复杂，一些流行病学的研究已经开始探索-胡萝卜素以及抗氧化剂与冠心病之间的关系。有研究指出，高类胡萝卜素膳食的人群患心血管疾病的危险性较低。1992年，Stahelin等证实血液类胡萝卜素水平与局部缺血型心脏病之间存在反比关系，1994年，Moms等研究发现，血液中总类胡萝卜素水平与冠心病的发病危险成反比。同年，Street等的研究表明，玉米黄素和黄体素均可显著地降低心肌梗塞的发病率。1997年和1999年，Iribarren和Stephen等研究了血液中的-胡萝卜素、-胡萝卜素、黄体素、玉米黄素、隐黄素、番茄红素等对颈总动脉内膜血管中层增厚的影响，发现在所研究的类胡萝卜素中，玉米黄素和黄体素降低颈总动脉内膜血管中层增厚的能力最强。2. 玉米黄素在食品方面的应用2.1天然着色剂类胡萝卜素呈天然的黄色或桔黄色，是一种有效的着色剂。在家禽体内，类胡萝卜素沉积于爪、啄及皮下脂肪中使其着色，提高家禽朋体品质。在产蛋家禽的体内类胡萝卜素沉积于卵黄中使其呈黄色，提高蛋的品质。鱼虾类肤色的深浅取决于类胡萝卜素的摄食量。Storebadden等证明，胡萝卜素能在动物肌肉中沉积，改善鱼体的色泽。冈口茂等研究发现斑节对虾体内类胡萝卜素含量在2.3-33.1 mg/kg之间，一般虾体色越浓，类胡萝卜素含量也越高。世界各国对有特殊价值食品都很重视，己有50多个国家批准-萝卜素作为黄色素加入食品中。大量用于人造黄油、饮料、烘焙食品等。在制药上，类胡萝卜素可用于糖衣药片的染色。根据类胡萝卜素用量多少，可以得到不同的颜色。2.2抗氧化剂将玉米黄素与常用的抗氧化剂BHT进行抗氧化能力的测定比较,结果表明,经氧化处理后40min内,加有玉米黄素的样品中-胡萝卜素的光密度下降较少,总体上来说玉米黄素的抗氧化能力与BHT相当。因此,作为天然、营养的添加剂玉米黄素,有望代替合成的抗氧剂BHT在食品中广泛应用。2.3新型饮料 玉米黄素广泛存在于水果、蔬菜、花卉中,鉴于此,美国新奥尔良食品研究所与Kemin公司合作,共同推出含5%叶黄素加玉米黄素等类胡萝卜素营养成分的眼保健饮料。该饮料所用的玉米黄素是从金盏花等植物中提取的,为绿色天然保健品。同时,美国FDA已批准玉米黄素为新型营养添加剂使用于食品中,其用量一般不超过5%。我国可借鉴此技术,利用国内资源,开发出特色保健饮料。盐藻突变株结果1三种光照强度对突变型藻株Zea1、野生型藻株生长和累积玉米黄素影响显著不同。HL对WT和Zea1的生长和积累玉米黄素都起着较强的促进作用，随着光照的增强，WT和Zea1藻细胞生长和玉米黄素积累都会加强，相比与NL和LL，HL明显有利于Zea1藻细胞生长和玉米黄素的积累。2培养基“老化”不利于Zea1藻生长，而实验组却有利于Zea1的生长。每隔一天离心更换新鲜培养液有利于Zea1藻细胞的生长，对照组藻细胞密度随着天数增长逐渐低于实验组藻细胞密度，培养基“老化”不利于盐藻生长。同样对于藻细胞积累玉米黄素而言，情况也相同,培养基“老化”不利于突变株藻细胞积累玉米黄素。3突变株Zea1生长和积累玉米黄素对NaCl的浓度要求大致相同，NaCl浓度大约为0.75mol/L最适宜Zea1藻细胞生长，1mol/L时最适宜藻细胞内积累玉米黄素。高浓度和低浓度时抑制了藻细胞的生长和玉米黄素的积累。4在葡萄糖、蔗糖、NaHCO3，3种碳源中，相比与另外两种碳源，葡萄糖效果最佳，它在中浓度时既适合Zea1藻细胞生长，同时又有利于藻体内玉米黄素的积累。5在3种氮源(NH4)2SO4、KNO3、NaNO3中，1mmol/L的KNO3最适合突变株藻细胞生长，而1mmol/L的(NH4)2SO4最有利于藻细胞内玉米黄素的积累。但综合整体效果来看，(NH4)2SO4为最佳。6 Zea1积累玉米黄素所需要的KH2PO4浓度较低，在0.1mmol/L时藻细胞内积累玉米黄素含量最高，同时在此浓度下也最有利于藻细胞的生长，因此盐藻生长和积累玉米黄素所需的KH2PO4浓度最适为0.1mmol/L。7响应面实验结果表明：因变量藻细胞数与玉米黄素含量和全体自变量之间的线性关系显著，响应面方程高度显著，响应面实验方法可靠。对于突变株Zea1藻细胞生长和积累玉米黄素来说，氮源的影响最大，然后是磷源、碳源。响应面实验得出的最优水平组合是，葡萄糖为12.33mmol/L，(NH4)2SO4为0.94mmol/L，KH2PO4为0.23mmol/L。响应面模型预测达到的藻细胞数最大值为28.338105个/ml，积累玉米黄素最高含量为31.386mg/g，通过最优化组合实验检测，实际值分别与理论预测值相差0.774和0.697，相对误差低于5%，说明采用响应面分析法优化得到的参数准确可靠。六、利用雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）生产虾青素虾青素的生理功能1抗氧化功能 虾青素具有很长的共扼双键，位于共扼双键链末端的不饱和酮基、经基，其中羟基和酮基又构成a一羟基酮，这些独特的分子结构均具有活泼的电子效应，能向自由基提供电子或吸引自由基的未配对电子，易与自由基反应而清除自由基，起到抗氧化作用。虾青素的抗氧化作用比其它类型的类胡萝卜素更强，其清除自由基的能力和淬灭单线氧的活性比维生素E强550倍，比玉米黄质、番茄红素、叶黄素、角黄素以及-胡萝卜素等其它的类胡萝卜素高10倍，是花青素的17倍，故称其为“超级维生素E”。研究发现不同色素淬灭分子氧的能力不同，其大小顺序为虾青素-胡萝卜素-胡萝卜素红木素玉米黄质黄体素胆红素胆绿素。 虾青素具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力，其对人类身体的健康起着极其重要的作用，可有效地防止组织、细胞和DNA被氧化损伤(汪洪涛，2006)。具体功能如下: (l)显著增强肌体免疫力虾青素可增强T细胞，刺激人体内血细胞产生免疫球蛋白;能显著增强肌体的免疫系统功能，增加肌体对病毒、细菌、寄生生物等的抵抗力；对恢复老龄动物的体液免疫系统作用明显。此外，其在抗原入侵初期增强特异性体液免疫反应的效果优于-胡萝卜素等物质。 (2)卓越的抗癌、防癌特性虾青素可有效的抑制癌变，对膀胧癌、口腔癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和肝癌等众多癌症均有显著的抑制效用，且所需剂量较小。 (3)优良的抗衰老、防老化能力虾青素强大的抗氧化活性使其成为高效的光保护剂，通过口服可起到阻止皮肤光老化的作用，且作用效果优于维生素A、雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究-胡萝卜素和叶黄素。此外，虾青素可以强化需氧代谢，增强肌肉力量和耐受力，起到抗衰老的作用。 (4)卓越的防治心血管等疾病功效不饱和脂肪酸具有降压、降血脂、改善血液品质等功用，而虾青素则是人体内不饱和脂肪酸的保护剂，防止其被氧化从而降低心血管疾病的发病率。此外，虾青素有效防止视网膜氧化和感光器细胞损伤，维护视觉系统的健康。同时，虾青素由于受到氧化损伤而导致的脊髓损伤、帕金森氏综合症等多种中枢神经系统损伤具有显著疗效。2着色功能 虾青素是一种粉红色的类胡萝卜素，是类胡萝卜素生物合成途径的合