福林酚法测蛋白.doc

福林-酚法的原理 该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸(FolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5100g蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。【仪器与用具】试管若干；刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套(带橡胶管)；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50l 1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。【试剂】NA2WO42H2O；NA2MoO42H2O；85H3PO4；浓HCl；LI2SO4H2O；溴水；酚酞指示剂；NA2CO3；NAOH；CuSO45H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。【方法】1试剂的配制(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4碳酸钠(NA2CO3)溶液与0.2MolL氢氧化钠(NAOH)溶液等比例混合(2NA2CO3，01Mol NAOH)；B液：1硫酸铜(CuSO45H2O)溶液与2酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5CuSO45H2O，0.1酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按501的比例混合即成。此为FolIn酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(NA2WO42H2O)100g、钼酸钠(NA2MoO42H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85的H3PO450Ml，浓HCl 100Ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(LI2SO4H2O)150g，水50Ml，溴水23滴，不用回流装置开口煮沸15Min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000Ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15Min)。使用时用标准NAOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1MolL H酸，此为FolIn酚试剂乙液(FolIn试剂)。在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。（2）标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白，溶于100Ml蒸馏水中，使最终浓度为250gMl。2标准曲线的绘制（1）取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0g、25g、50g、100g、150g、200g、250g(必要时可做重复)。(2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30下放置10Min。(3)在每支试管中喷射加入0.5Ml乙液，立即振荡混匀，在30下保温30Min。(4)准确到30Min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1CM光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。3样品的测定(1)样品的提取：称取鲜样05g，用5Ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。取10Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3)、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。(2)根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。4结果计算样品中蛋白的含量(Mgg)CVTV1FW1000(2-1）式中C:查标准曲线值(g)；VT:提取液总体积(Ml)；FW:样品鲜重(g)；V1:测定时加样量(Ml)。【注意】还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。/http:/www.cdxy