仪器分析hplc复习版1011课件

2020 2 23 第三章高效液相色谱分析HPLC 高效液相色谱法以气相色谱为基础 在经典液相色谱实验和技术基础上 采用颗粒很细的固定相以及高压泵输送流动相建立的一种液相色谱法 2020 2 23 3 1高效液相色谱法的特点 高压150 350 105Pa高速比经典LC快数百倍 流速可达1 10mL min 1高效大于30000塔板 米高灵敏度 10 9g 紫外检测 10 11g 荧光检测 所需试样量很少 微升试样足以全分析试样不被破坏 易回收 分析重现性好应用范围广泛可分析80 有机化合物 尤适于高沸点 热不稳定 相对分子量大 400 有机及生化试样的分离分析 2020 2 23 相同 兼具分离和分析功能 均可以在线检测主要差别 分析对象的差别和流动相的差别 1 分析对象的区别GC 适于能气化 热稳定性 沸点较低的样品 占有机物的20 HPLC 试样不需气化 只需制成溶液 即可在室温下进样分析不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大 高沸点 热稳定性差及生化样品 高分子和离子型样品均可检测用途广泛 占有机物的80 HPLC与GC差别 2020 2 23 2 流动相的区别GC 流动相为惰性气体对组分无亲合作用 仅起运载作用 HPLC 流动相可选用不同极性的液体与组分有亲合作用力 通过参与固定相对组分作用的竞争 提高柱的选择性 改善分离度 为选择最佳分离条件提供了极大方便 流动相种类较多 选择余地广 改变流动相极性和pH值对分离起到调控作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可增大分离选择性 2020 2 23 3 操作条件差别GC 较高温度下进行HPLC 室温 高压 液体粘度大 峰展宽小 高效液相色谱法的主要缺点 仪器设备费用昂贵操作严格 2020 2 23 一 速率理论 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 3 2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 2020 2 23 1 涡流扩散项及其影响 讨论 降低固定相粒度可提高柱效 2 传质阻力项及其影响 液体的黏度比气体大一百倍 密度为气体的一千倍 故降低传质阻力是提高柱效主要途径 2020 2 23 Hm为流动相对板高影响项Hsm为固定相微孔内流动相对板高影响项Hs为固定相 液 对板高影响项 2020 2 23 液相色谱中 不可能通过增加柱温来改善传质室温 25 左右 改变流动相组成 极性是改善分离最直接的因素 2020 2 23 1 流动相及其流速的选择 二 分离条件的选择 2020 2 23 2 2020 2 23 3 固定相及分离柱的选择气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱 其选用原则与气相色谱一样选粒径小的 分布均匀的球形固定相 dp 10 m 首选化学键合相 湿法匀浆法装柱高效液相色谱中 分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作 一般很少自行制备 2020 2 23 4 洗脱方式 1 等度洗脱 恒组成溶剂洗脱 以固定配比的溶剂系统洗脱组分 一个泵 类似GC的等温度洗脱2 梯度洗脱 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性 两个泵 适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温 沸程较长样品 2020 2 23 一 液 液分配色谱LLC和化学键合相色谱CBPC 固定相与流动相均为液体 互不相溶 流动相 亲水性固定液 采用疏水性流动相即流动相的极性小于固定液的极性 正相NPLC 流动相的极性大于固定液的极性 反相RPLC 正相与反相的出峰顺序相反固定相 化学键合固定相 3 3HPLC的主要类型及其分离原理 正相色谱主要用于极性物质的分离测定反相色谱主要用于非极性 中等极性物质的分离测定 2020 2 23 二 液 固吸附色谱 LSC 固定相 固体吸附剂为 如硅胶 氧化铝等 较常使用的是5 10 m的硅胶吸附剂流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂 流动相为液体 固定相为固体吸附剂 基本原理 组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 缺点 非线形等温吸附常引起峰的拖尾 2020 2 23 三 离子交换色谱 固定相 强碱性和弱碱性阴离子交换树脂 强酸性和弱酸性阳离子交换树脂流动相 阴离子交换树脂作固定相 采用酸性水溶液 阳离子交换树脂作固定相 采用碱性水溶液 基本原理 组分在固定相上发生的反复离子交换反应 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 亲和力大 保留时间长阳离子交换 R SO3H M R SO3M H 阴离子交换 R NR4OH X R NR4X OH 应用 离子及可离解的化合物 氨基酸 核酸等 2020 2 23 四 离子对色谱 IPC 原理 将与待测物离子A电荷相反的离子B 称为对离子或反离子 加入到流动相中 使待测离子与对离子形成离子对AB 该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同 即间接改变了待测离子的保留特性 离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱 离子对色谱法特点 1 分离效果高2 分析速度快3 操作简便4 强极性有机酸 碱等难分离的混合物的分离 2020 2 23 五 离子色谱IC 离子色谱是由离子交换色谱派生的一种分离方法 离子交换分离柱后加一根抑制柱 装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相 从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量 这种色谱技术称为离子色谱 离子色谱是分析水溶液中阴离子的最佳方法 2020 2 23 若样品为阳离子 用无机酸作流动相 抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂 当试样经阳离子交换剂的分离往后 随流动相进入抑制柱 在抑制柱中发生两个重要反应 R OH H Cl R Cl H2OR OH M Cl R Cl M OH 经抑制柱后 一方面将大量酸转变为低电导的水 消除了流动相本底电导的影响 同时 又将样品阳离子M 转变成相应的碱 由于OH 离子的淌度为Cl 离子的2 6倍 提高了所测阳离子电导的检测灵敏度 2020 2 23 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱 由于抑制柱要定期再生 而且谱带在通过抑制柱后会加宽 降低了分离度 Frits等人提出不采用抑制柱的离子色谱体系 而采用电导率极低的溶液 例如1 10 4 5 10 4mol dm 3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相 称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱 思考 IC分离中 何为抑制柱 分析阴离子时 抑制柱中应填充何种离子交换树脂 2020 2 23 六 空间排阻色谱 固定相 凝胶 具有一定大小孔隙分布 原理 按分子大小分离 小分子扩散到凝胶空隙 出峰最慢 中等分子只能部分通过凝胶空隙 出峰其次 大分子被排阻 出峰最快 溶剂分子很小 最后出峰 全部在死时间前出峰可按质量分离相对分子量在102 105范围内的化合物 2020 2 23 3 4液相色谱固定相 1 液 液分配及离子对色谱固定相 1 全多孔型担体由氧化硅 氧化铝 硅藻土等制成的多孔球体 由于颗粒很细 5 10 m 孔较浅 传质速率快 易实现高效 高速 特别适合复杂混合物分离及痕量分析 2 表面多孔型担体 薄壳型微珠担体 优点 多孔层厚度小 孔浅 相对死体积小 出峰迅速 柱效高 颗粒较大 渗透性好 装柱容易 梯度淋洗时能迅速平衡 适合做常规分离分析缺点 由于多孔层厚度薄 表面积小 最大允许量受限制 2020 2 23 3 化学键合固定相 化学键合固定相 目前应用最广 性能最佳的固定相a 硅氧碳键型 Si O Cb 硅氧硅碳键型 Si O Si C稳定 耐水 耐光 耐热 耐有机溶剂 应用最广c 硅碳键型 Si Cd 硅氮键型 Si N 化学键合固定相的特点 1 传质快 表面无深凹陷 比一般液体固定相传质快 2 寿命长 化学键合 无固定液流失 耐流动相冲击耐水 耐光 耐有机溶剂 稳定 4 选择性好 可键合不同官能团 提高选择性 5 有利于梯度洗脱 2020 2 23 2 液 固吸附分离固定相 种类 硅胶 氧化铝 分子筛 聚酰胺等结构类型 全多孔型和薄壳型目前常用的是全多孔型固定相 粒度 5 10 m 3 离子交换色谱分离固定相 1 阳离子交换树脂 强酸性 弱酸性 2 阴离子交换树脂 强碱性 弱碱性 4 空间排阻色谱固定相 1 软质凝胶 2 半硬质凝胶 3 硬质凝胶 2020 2 23 3 5液相色谱的流动相 1 流动相特性与GC流动相不同 HPLC流动相为溶剂 它既有运载作用 又和固定相一样 参予对组分的竞争因此溶剂的选择对分离十分重要 1 液相色谱的流动相又称为 淋洗液 洗脱剂流动相组成改变 极性改变 可显著改变组分分离状况 2 亲水性固定液常采用疏水性流动相极性柱也称正相柱 非极性柱也称为反相柱 2020 2 23 2 流动相类别 按流动相组成分 单组分和多组分按极性分 极性 弱极性 非极性按使用方式分 固定组成淋洗和梯度淋洗常用溶剂 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 乙腈 水采用二元或多元组合溶剂作为流动相可灵活调节流动相的极性或增加选择性以改进分离或调整出峰时间 2020 2 23 3 流动相选择 选择溶剂时 溶剂极性是重要依据采用正相液 液分配分离时 首先选择中等极性溶剂 若组分的保留时间太短 降低溶剂极性 反之增加也可在低极性溶剂中 逐渐增加其中的极性溶剂 使保留时间缩短常用溶剂的极性顺序 水 最大 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 煤油 最小 2020 2 23 4 选择流动相时应注意的几个问题 1 尽量使用高纯度试剂作流动相 2 化学稳定性好避免与固定相发生作用使柱效下降或损坏柱子 3 试样在流动相中应有适宜的溶解度 4 低粘度常用的低粘度溶剂有丙酮 乙醇等 5 流动相与检测器匹配如使用紫外检测器时 流动相不应有紫外吸收对折光率检测器 要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相 以达最高灵敏度 2020 2 23 HPLC仪器包括 1 高压输液装置 包括贮液器 脱气装置 高压泵 梯度混合器 管路等2 进样系统 进样器注意每次进样后的洗涤3 分离系统 包括保护柱 分离柱4 检测系统 常用检测器为紫外检测器 二极阵列检测器 荧光检测器 示差检测器等 3 6液相色谱仪 5 控制和数据处理系统 电脑和工作站 2020 2 23 1 高压输液系统1 贮液器 1 2L的玻璃瓶 配有溶剂过滤器 2 脱气 流动相要脱气 否则出现线状峰 气多时泵不能工作 3 高压泵 要求 密封性好 流量稳定无脉动 可调范围宽 耐腐蚀 2 主要部件 2020 2 23 内梯度 高压梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 外梯度 低压梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 4 梯度淋洗装置 分离过程中逐渐改变流动相组成的装置 内梯度 高压梯度 效果好 2020 2 23 与GC相比 HPLC柱要短得多 因此由于柱本身产生的峰形展宽相对要小些 即 HPLC的展宽多因一些柱外因素引起 这些因素包括 进样系统 连接管道及检测器的死体积 3 进样装置 4 色谱柱 柱子类型可以是正相柱 反向柱 离子交换柱 多糖柱 蛋白柱等 根据需要来定 一般分离前备有一根很短的保护柱 柱内填充物和分离柱一样 流动相进入分离柱之前 通过保护柱 主要去除样品中强吸附成分和杂质 2020 2 23 5 液相色谱检测器 1 紫外检测器应用最广 对大部分有机化合物有响应适于吸收紫外光的物质特点 灵敏度高 最小检测浓度达10 9g mL 1 线形范围高 流通池很小 1mm 10mm 容积8 L 对流动相的流速和温度变化不敏感 可用于梯度洗脱波长可选 易于操作不适于对紫外完全不吸收试样溶剂的选用受限制 2020 2 23 2 荧光检测器 特点 高灵敏度 高选择性 但线性范围窄 仅有103应用范围 许多有机物具荧光活性 尤其是芳香族化合物具有很强的活性 如多环芳烃 维生素B 黄曲霉素 卟啉类化合物等 以及一些生化物质如某些代谢产物 药物 氨基酸 甾类化合物等都有响应 对有些不发射荧光的物质可化学衍生成发荧光物质进行检测 2020 2 23 原理 利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品 溶剂相 根据二者对光的折射率不同 其中一束 通常是通过样品 溶剂相 光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化 将此差示信号放大并记录 该信号代表样品的浓度 3 差示折光检测器 差示折光检测器是除紫外检测器之外应用最多的检测器 差示折光检测器为通用型检测器 灵敏度为10 7g mL但对温度变化敏感 且不适于梯度淋洗 2020 2 23 4 电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测原理 基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导 电阻的倒数 变化来测量电离物质的含量电导检测器的主要部件是电导池 其响应受温度影响较大 故需将电导池置于恒温箱中另外 当pH 7时 该检测器不够灵敏 其它检测器 MS IR 蒸发光散射检测器 极谱等 2020 2 23 3 7分离类