2012（终版）第十三章 急性毒性试验课件

2020 2 23 任立群 1 第十三章急性毒性作用及其评价方法 2020 2 23 任立群 2 第一节 基本概念 2020 2 23 任立群 3 急性毒性 Acutetoxicity 是指24小时内单次或多次大剂量给予某药物所出现的有害作用 亦即指机体一次性大剂量接受某种药物后所产生的快速而剧烈的中毒反应 包括死亡效应 一 基本概念 急性毒性试验 Acutetoxicitytest 是为观察和评价急性毒性的有害作用或中毒反应而设计的一种毒理学试验 2020 2 23 任立群 4 总的来说 急性毒性试验以阐明药物的剂量 毒效应关系为出发点 为全面的毒性试验打下基础 2020 2 23 任立群 急性毒性试验的目的 意义 2020 2 23 任立群 6 二 急性毒性评价的基本要求 急性毒性试验是临床前新药安全性评价的第一步 与其它毒性试验相比 具有简单 经济 易行等特点 因此新药研究开发时往往通过该项试验 尽可能多的了解新药的一些毒理学特点 为早期判断侯选新药是否具有研究开发价值提供毒性强度资料 2020 2 23 任立群 7 包括两方面的内容 定性 毒性反应的类型 出现和消失时间 可能的靶器官和死亡原因等 定量 致死量 最大给药量 半数致死量等 2020 2 23 任立群 8 给药 一般状态的观察 处死动物 取受累组织或器官 将受试动物分组 一般程序 病理组织学检查 二 急性毒性评价的基本要求 2020 2 23 任立群 9 一般程序 注意 1 试验过程中对死亡动物最好进行尸检 2 为提高实验的重现性 必须使所有的实验条件及方法规范化 根据GLP的有关规定进行操作 二 急性毒性评价的基本要求 2020 2 23 任立群 10 基本要求 药物研究技术指导原则 采用两种给药途径 至少选用两种实验动物 给药后观察7 14天动物毒性反应和死亡情况 二 急性毒性评价的基本要求 2020 2 23 任立群 11 基本要求 至少选用两种实验动物 小动物如啮齿类要求做出LD50 药物毒性很小做不出LD50时 可用最大药物浓度 最大给药体积进行最大耐受量试验 大动物如犬可测定单次给药的近似致死量和最大耐受量 药物研究技术指导原则 二 急性毒性评价的基本要求 小动物如啮齿类要求做出LD50 药物毒性很小做不出LD50时 可用最大药物浓度 最大给药体积进行最大耐受量试验 大动物如犬可测定单次给药的近似致死量和最大耐受量 2020 2 23 任立群 12 基本要求 至少选用两种实验动物 药物研究技术指导原则 二 急性毒性评价的基本要求 2020 2 23 任立群 13 基本要求 采用两种给药途径 其中有一种必须与临床用药途径相同 药物研究技术指导原则 二 急性毒性评价的基本要求 2020 2 23 任立群 14 基本要求 给药后观察7 14天动物毒性反应和死亡情况 对死亡动物及时进行尸检 如发现肉眼可见的病变应进行病理学检查 如果做LD50测定则推荐用Bliss法计算其LD50值和95 可信限 药物研究技术指导原则 二 急性毒性评价的基本要求 2020 2 23 任立群 15 XXX急性毒性结果及LD50计算 2020 2 23 任立群 16 各国对急性毒性试验的基本要求 各国药政部门对急性毒性试验的基本要求有所不同 二 急性毒性评价的基本要求 2020 2 23 任立群 17 第二节 LD50的测定 2020 2 23 任立群 18 一 LD50的定义及其测定意义 LD50定义 在一定试验条件下 能引起一群实验动物50 死亡所需的剂量 2020 2 23 任立群 19 1 LD50是药物的重要特征性参数之一 是药物及一切与人类接触物质的安全标尺 常被用来判断药物对机体的毒性程度 其数值越大 说明该药物越安全 2 有助于计算其它与LD50相关的毒性参数 补充LD50不足 一 LD50的定义及其测定意义 2020 2 23 任立群 20 急性毒作用带 急性毒作用带的大小反应了急性阈剂量与LD50距离的宽窄 其比值越大 说明从急性阈剂量到死亡剂量的距离越宽 药物引起死亡的危险性就越小 比值越小 则引起死亡的危险性就越大 与LD50相关的毒性参数之一 2020 2 23 任立群 21 治疗指数 Therapeuticindex TI 是指半数致死量与半数有效量之比值 治疗指数 TI值越大 表示该药物在发挥其治疗作用时所承担的风险 危险性 越小 一般认为TI大于3的药物才可能具有实用价值 目前用于临床的药物 其TI值大多大于10 与LD50相关的毒性参数之二 2020 2 23 任立群 22 1 LD50是药物的重要特征性参数之一 是药物及一切与人类接触物质的安全标尺 常被用来判断药物对机体的毒性程度 其数值越大 说明该药物越安全 2 有助于计算其它与LD50相关的毒性参数 补充LD50不足 一 LD50的定义及其测定意义 3 作为药物急性毒性分级的依据 化学药物急性毒性分级 WHO 按药物的LD50进行相对急性毒性分级 可粗略地表示其急性毒性的强弱和对人潜在的危害程度 2020 2 23 任立群 24 小鼠LD50 mg kg体重 口服皮下注射静脉或腹腔注射毒药 30 20 10剧药 300 200 100普通药 300 200 100 毒 剧药的划分 在临床 药物有毒药 剧药 普通药之分 有人认为可参考药物的LD50值加以划分 25 20 剧药 药理作用剧烈 极量与致死剂量很接近 小剂量时产生治疗作用 超过极量即有可能中毒甚至造成死亡的药品 作用剧烈但程度稍弱的药品 概念 毒药 2020 2 23 任立群 26 1 LD50是药物的重要特征性参数之一 是药物及一切与人类接触物质的安全标尺 常被用来判断药物对机体的毒性程度 其数值越大 说明该药物越安全 2 有助于计算其它与LD50相关的毒性参数 补充LD50不足 一 LD50的定义及其测定意义 3 作为药物急性毒性分级的依据 4 为长期毒性试验 特殊毒性试验和临床药理评价提供观察指标及剂量设计依据 5 为毒效应的靶器官确定和机制分析提供线索 6 作为药物生产过程中的质量监控检测措施 2020 2 23 任立群 27 一 实验动物 尽量选择急性毒性反应与人近似的动物 易于饲养管理 试验操作方便的动物 繁殖生育力较强 数量较大能够保障供应 价格较低 易于获得的动物 在基础性研究工作中 按科研课题的具体要求选择 在法规性毒理学评价工作中 必须按照其规范要求进行 选择原则 二 LD50测定的设计原则及方法 2020 2 23 任立群 28 在LD50的测定中 实验动物常选用啮齿类的小鼠或大鼠 尤其是小鼠 1 动物种类 一 实验动物 2020 2 23 任立群 小鼠的优点是 繁殖周期短 产仔多 生长速度快 体型小 饲料消耗少以及毒理学背景资料较多 比较温顺便于捕捉 操作方便 试验的准确性和一致性好 大鼠的优点是 代谢及毒性反应与人类较为接近 1 动物种类 一 实验动物 30 20 生物转化形式和速率 大 小鼠的LD50值存在明显的差别 已知药物在啮齿类与非啮齿类之间其存在差异 进一步确定毒效应表现 LD50 考虑敏感动物 但在下列情况时可以考虑用一种非啮齿类动物 一般选用家犬或猴 2020 2 23 任立群 31 无论使用何种动物都必须注明动物的来源 品系 年龄 体重 性别 饲养条件以及动物生产合格证书 如系无特殊病原体动物也应在报告中注明 2020 2 23 任立群 32 2 健康状况 一 实验动物 2020 2 23 任立群 33 3 体重与年龄 同一批实验中 动物的年龄 体重应尽可能一致 动物的初始体重变异要求不超过平均体重的 20 幼年动物一般较成年动物对毒物敏感 急性毒性试验原则上选用年轻的成年动物 啮齿类动物的年龄一般为7 9周龄 非啮齿类动物为6 8月龄 一 实验动物 2020 2 23 任立群 34 3 体重与年龄 同一批实验中 动物的年龄 体重应尽可能一致 动物的初始体重变异要求不超过平均体重的 20 幼年动物一般较成年动物对毒物敏感 急性毒性试验原则上选用年轻的成年动物 啮齿类动物的年龄一般为7 9周龄 非啮齿类动物为6 8月龄 一 实验动物 2020 2 23 任立群 35 常用实验动物的生活年限及体重选择 2020 2 23 任立群 36 试验前 后 包括实验中死亡的动物 应各称取体重一次 以观察给药后引起的变化 一般认为在保持正常的食耗及环境条件下 出现体重下降应看作是毒效应的一种表现 3 体重与年龄 一 实验动物 2020 2 23 任立群 37 4 动物性别 动物性别不同对毒物的敏感性也不同 这与性激素有关 也随药物而异 急性毒性试验中应考虑雌雄动物数目相等 一般不应做单性别动物的LD50 但在试验中如发现某性别动物的死亡率明显高于另一性别时 则最好对该性别的LD50另外计算 或考虑选用敏感性别的动物重新进行急性毒性试验 一 实验动物 2020 2 23 任立群 38 4 动物性别 动物性别不同对毒物的敏感性也不同 这与性激素有关 也随药物而异 急性毒性试验中应考虑雌雄动物数目相等 一般不应做单性别动物的LD50 但在试验中如发现某性别动物的死亡率明显高于另一性别时 则最好对该性别的LD50另外计算 或考虑选用敏感性别的动物重新进行急性毒性试验 一 实验动物 2020 2 23 任立群 39 5 动物分组方法 随机原则 随机分组可使动物形成一个均匀的整体 并可减少因个体差异而造成的误差 体重或健康状况不符合要求的动物应在随机分组前剔除 一 实验动物 2020 2 23 任立群 40 6 动物给药前禁食处理 如经口途径染毒 实验动物胃肠道内食物存留影响药物毒性及给药容积 因此在试验前应作禁食处理 大鼠要求染毒前应隔夜禁食 一般在前一天傍晚下班时或晚间将饲料撤掉 小鼠和大鼠基本类似 但由于其消化吸收和代谢速度较快 可隔夜禁食也可禁食4小时以上 大动物常在上午染毒 前一天正常给食 染毒前不喂食即可 一 实验动物 2020 2 23 任立群 41 禁食期间均正常给水 染毒2小时后提供饲料 经口多次染毒 可不禁食 一 实验动物 6 动物给药前禁食处理 2020 2 23 任立群 42 二 剂量水平的选择 剂量水平的选择应是以测定LD50及剂量 反应曲线的斜率为目的 具体方法 设法选择引起约半数动物死亡的一个剂量 死亡率在50 附近 死亡率分别大于半数的剂量 最好小于90 和小于半数的剂量 最好大于10 各一个 通常选择4个以上的剂量 希望其中至少有3个剂量组落在上述10 90 的死亡范围之内 2020 2 23 任立群 43 对于全新结构的药物或中草药复方 1 先以小批量动物预实验 找出0 及100 估计致死量 即Dmin和Dmax 再求出i值 2 以Dmin的对数为起点 向上推出n组动物的各组剂量的对数值 3 求出反对数即可求得各组的剂量 对于已知化学类别的药物 通过文献检索确定预期毒性中值 再按一定组间距 i 上下各推二个剂量 二 剂量水平的选择 2020 2 23 任立群 44 1 对于已知化学类别的药物 1 先确定预期毒性中值 LD50 根据其所属化学类别及其所含的特殊基团 查阅有关文献 找出与其结构近似或有共性基团的药物的毒性资料 了解药物的理化性质 综合考虑这两方面的资料 选择与药物的化学结构和理化性质最为接近的己知药物的LD50作为药物的预期毒性中值 二 剂量水平的选择 2020 2 23 任立群 45 1 先确定预期毒性中值 LD50 2 以LD50为中间剂量 推算预试验的剂量分组 以确定的预期毒性中值 LD50 为中间剂量 再按一定的组间距 i值 剂量的对数值等差分布 剂量等比分布 上下各推二个剂量 作为预试验的剂量分组 预试时 组间距可稍大些 i值可取0 6 相邻剂量比为1 4 如果估计药物的致死剂量范围较窄 组间距可适当缩小 i值取0 2 相邻剂量比为1 1 6 相邻的两个剂量组对数剂量之差 二 剂量水平的选择 1 对于已知化学类别的药物 2020 2 23 任立群 46 1 先确定预期毒性中值 LD50 2 以LD50为中间剂量 基准 推算预试验的剂量分组 3 确定正式试验的具体分组方案 二 剂量水平的选择 1 对于已知化学类别的药物 通过上述预试验找出药物使10 90 实验动物死亡剂量的大致范围 再据此确定正式试验的具体分组方案 此时可按下式求算组间距 i值 或 2020 2 23 任立群 48 式中n为剂量组数 上述公式求得的i值加上最低剂量组 第1组可用预试验的LD10或LD0 剂量的对数值即得低剂量组 第二组 剂量的对数值 依此类推至最高剂量组 第n组 求出各值的反对数即得各剂量组的真实剂量数值 2020 2 23 任立群 49 2 对于全新结构的药物或中草药复方 先通过小批量动物的摸索 找出0 及100 估计致死量 即Dmin和Dmax 再求出i值 具体步骤如下 二 剂量水平的选择 2020 2 23 任立群 50 二 剂量水平的选择 2 对于全新结构的药物或中草药复方 1 以10倍稀释的药物浓度系列 用少量动物 每组2 3只 找出大致死亡范围 确定预期毒性中值 LD50 2020 2 23 任立群 51 剂量死亡数 动物数5mg kg0 250mg kg1 2500mg kg2 25000mg kg2 2上述结果提示 大致死亡范围为50mg kg 500mg kg 例如某一药物此试验结果为 2020 2 23 任立群 52 1 以10倍稀释的药物浓度系列 用少量动物 每组2 3只 找出大致死亡范围 确定预期毒性中值 LD50 2 再用1 2 4 8 等2倍稀释的药物浓度每组4只物实验 找出Dmin和Dmax 二 剂量水平的选择 2 对于全新结构的药物或中草药复方 例如在此例中结果为 剂量死亡数 动物数50mg kg0 4100mg kg2 4200mg kg2 4400mg kg4 4800mg kg4 4 例如在此例中结果为 剂量死亡数 动物数50mg kg0 4100mg kg2 4200mg kg2 4400mg kg4 4800mg kg4 4 例如在此例中结果为 剂量死亡数 动物数50mg kg0 4100mg kg2 4200mg kg2 4400mg kg4 4800mg kg4 4 Dmax的确定 当出现4 4死亡时 如其前一组为3 4死亡 则取4 4组的剂量为Dmax 如前一组为2 4或1 4死亡 如本例为2 4 考虑到4 4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70 为慎重起见 可将4 4组的剂量乘以2作为Dmax 2020 2 23 任立群 56 例如在此例中结果为 剂量死亡数 动物数50mg kg0 4100mg kg2 4200mg kg2 4400mg kg4 4800mg kg4 4 Dmax 400 mg kg 70 2 560 mg kg 例如在此例中结果为 剂量死亡数 动物数50mg kg0 4100mg kg2 4200mg kg2 4400mg kg4 4800mg kg4 4 Dmin的确定 当出现0 4死亡时 如其后一组的死亡率为1 4 则取0 4组的剂量为Dmin 如后一组死亡率大于1 4 考虑到0 4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于70 则将0 4组的剂量除以2 作为Dmin 2020 2 23 任立群 58 例如在此例中结果为 剂量死亡数 动物数50mg kg0 4100mg kg2 4200mg kg2 4400mg kg4 4800mg kg4 4 Dmin 50 mg kg 70 2 35 mg kg 2020 2 23 任立群 59 例如在此例中结果为 剂量死亡数 动物数50mg kg0 4100mg kg2 4200mg kg2 4400mg kg4 4800mg kg4 4 陈奇 中药药理研究方法学 第2版Dmax 当出现4 4死亡时 如前一组死亡率为2 4Dmax 4 4死亡剂量 1 4 400 1 4 560 mg kg Dmin 当出现0 4死亡时 如后一组死亡率大于1 4Dmin 0 4死亡剂量 1 4 50 1 4 35 mg kg 2020 2 23 任立群 60 3 求得各组的剂量 二 剂量水平的选择 2 对于全新结构的药物或中草药复方 1 以10倍稀释的药物浓度系列 用少量动物 每组2 3只 找出大致死亡范围 确定预期毒性中值 LD50 2 再用1 2 4 8 等2倍稀释的药物浓度每组4只物实验 找出Dmin和Dmax 2020 2 23 任立群 61 求出组间距 i值 然后再依前法 以Dmin的对数为起点 向上推出n组动物的各组剂量的对数值 求出反对数即可求得各组的剂量 小鼠每组10只 雌雄各半 大鼠不应少于6 8只 2020 2 23 任立群 62 三 剂量组数及动物数 LD50测定中剂量组数的设计 除符合统计学要求外 还应根据预试验所提供的药物的毒性情况而定 一般而言 在实际工作中设5 7个剂量组 剂距以0 65 0 85为宜 2020 2 23 任立群 63 四 剂型与给药 溶于水的药物应当测定静脉给药途径的急性毒性 口服药物应灌胃给药 急性毒性试验常用动物单次给药的常用容量和最大容量 2020 2 23 任立群 65 应写明受试药物的名称 批号 来源 纯度 保存条件及配制方法 供试药品应能溶于或混悬于适当的溶媒 如果溶媒的毒性情况是未知的 则应设立一个溶媒对照组 溶媒对照组的给药容量应与最高剂量组相等 对所用的溶媒及助溶剂的种类 规格 批号及来源等 都必须有详细的记录 以备分析和审核 四 剂型与给药 2020 2 23 任立群 66 如果受试物为复方制剂 建议进行各成分单独给药的试验和按复方制剂比例联合给药的试验 以提示有无增毒作用 或是否出现新的毒性 如受试药物在贮存条件下易发生降解 建议以含降解产物量最高的受试物进行急性毒性试验 并与临床样品的急性毒性试验结果比较 四 剂型与给药 2020 2 23 任立群 67 但必须注意上述两种方式给药所观察到的毒性效应可能是不尽相同的 四 剂型与给药 2020 2 23 任立群 68 药物稀释后 局部刺激性往往会减轻 如研究目的是确认全身性毒性 应以等体积给药 以减轻因胃肠道的刺激而给影响药物的吸收 但是如果为了评价药物的剌激强度 应给予未经稀释的药物 等浓度 四 剂型与给药 2020 2 23 任立群 69 如果剂量较大而不便于一次给药 可分成相等的容量 每隔6 8小时给药一次 但必须在第一次给药后的24小时内给完 四 剂型与给药 2020 2 23 任立群 70 给药时间的重要性近年的研究证实 许多药物的LD50存在着昼夜节律的变化 例如 给小鼠注射100 g的大肠杆菌内毒素 其死亡率则表现出昼夜节律 上午8时给药 死亡率为46 下午4时给药 死亡率为90 晚上8时给药 死亡率为70 午夜0时给药 死亡率为15 所以对药物的LD50测定应注明给药时间 四 剂型与给药 2020 2 23 任立群 71 五 试验时限与量限 急性毒性试验必须观察7 14天 但一般不必超过两周 14天 急性毒性试验的观察时间取决于症状出现的时间 毒性强弱 致死速度 恢复速率以及受试物本身的代谢特征等 对于致死速度快的受试药物 可计算24小时的死亡率 对于致死较慢者可计算3 7天的死亡率 一般不必超过两周 时限 我国新药审批办法规定 2020 2 23 任立群 72 五 试验时限与量限 急性毒性试验必须观察7 14天 但一般不必超过两周 14天 时限 我国新药审批办法规定 因为给药两周以上死亡的动物 往往很难区分是药物中毒而死还是其它原因所致 通常在表示药物的LD50时最好同时注明观察时间 这样在毒性比较时 才会有共同的基础 2020 2 23 任立群 73 口服5g kg体重注射2g kg体重 量限 我国新药审批办法规定 对于毒性低的药物 可用最大给药浓度和最大给药容量单次或24小时内分次给药 一般使用20只啮齿类动物 连续观察7 14天 如无死亡出现 则该剂量即为药物的最大耐受剂量 在此剂量下如无死亡出现 通常可不必做更高的剂量 五 试验时限与量限 2020 2 23 任立群 74 六 观察指标 通过深入细致地观察试验动物的中毒症状及其发生 发展的过程与规律 死亡前症状特点 死亡所需时间的差异等 找出毒性作用的特征 初步获得药物毒效应的靶器官和受试动物的死亡原因 2020 2 23 任立群 75 1 笼边观察 特别要注意给药后 小时内动物中毒症状及死亡情况 观察的时间间隔及频度必须根据症状出现 恢复 变化及死亡时间而定 一般给药后持续观察30分钟 第1 4小时再观察1次 以后每天观察1次 六 观察指标 急性毒性试验中的一般毒性症状观察 2020 2 23 任立群 77 2 死亡过程与死亡时间 死亡过程的观察 有助于探讨中毒的机制或动物中毒的死亡原因 药物的毒效应是不同的 毒性作用 反应 出现的先后次序以及是否出现都可体现毒效应的差异 另外 毒性作用的性质也决定了致死性反应出现所需的时间 因此 从死亡时间也可间接地得到受试物毒作用性质的信息 六 观察指标 2020 2 23 任立群 78 3 体重 给药前 给药期间 每天或根据需要确定间隔 动物死亡时及实验终止时必须对每个动物进行称重 观察药物对动物体重的影响 六 观察指标 2020 2 23 任立群 79 引起体重减轻或增长率减慢的原因较为复杂 影响食欲或消化系统功能而厌食或拒食腹泻而影响食物的吸收和利用影响水的摄取肾功能急性损伤 因此 体重的变化要在全面观察的基础上仔细地加以分析 3 体重 六 观察指标 2020 2 23 任立群 80 4 尸体解剖及病理学检查 对于濒死的或己死亡的动物以及实验终止时尚存活的动物 必须进行系统的尸体解剖检查 病理组织学检查并非必要的检查项目 但是对于迟发死亡动物 尤其是发生 双峰 死亡现象时 即早期死亡较多 继之有所减少 然后又出现大批死亡 则应进行病理组织学检查 以便为死因的确认提供依据 六 观察指标 2020 2 23 任立群 81 根据毒性反应出现的时间 严重程度 持续时间等 分析各种反应在不同剂量时的发生率 严重程度 根据观察结果分析 判断每种反应的量效关系及随时间的变化 判断各种反应可能涉及的器官 组织或系统等 根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果 初步判断可能的毒性靶器官 七 结果处理与分析 2020 2 23 任立群 82 根据不同剂量组各种反应的发生率 动物死亡情况等 确定动物对受试物的最大无反应剂量 最小毒性反应剂量 最大耐受剂量 最小致死剂量等 初步判断药物的安全范围 对于需要测定LD50值的药物 采用合理的统计学方法求算LD50值 目前推荐使用Bliss法 七 结果处理与分析 2020 2 23 任立群 83 三 LD50的计算方法 一 LD50的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 其量 效关系应符合以下规律 1 剂量与死亡率之间呈偏态分布曲线关系 在一个群体中特别敏感的动物总是比较少的 特别不敏感的动物也较少 而多数动物处于中等敏感状态 即符合 两头少 中间多 的规律 2020 2 23 84 致死性反应是一种质反应过程 其量 效关系应符合以下规律 1 剂量与死亡率之间呈偏态分布曲线关系 如以剂量为横坐标 死亡率为纵坐标 则可绘出一个偏态曲线 剂量 死亡率的偏态分布曲线 一 LD50的统计学原理 2020 2 23 85 2 剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系 如将横坐标改为对数剂量 等比数列 则偏态曲线转化为对称的常态曲线 对数剂量 死亡率的常态分布曲线 死亡反应发生率 一 LD50的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 其量 效关系应符合以下规律 86 2 剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系 若 为反应中值 为标准差 曲线下包含的总面积等于1 在 1 的范围内 曲线下所包含的面积为68 07 也即动物死亡率占总死亡率的68 07 2 的范围内所包含的面积为95 45 3 为99 73 对数剂量 死亡率的常态分布曲线 死亡反应发生率 一 LD50的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 其量 效关系应符合以下规律 87 3 剂量对数值与累积死亡率之间呈S形曲线关系 累积死亡率与对数剂量的关系 一 LD50的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 其量 效关系应符合以下规律 2020 2 23 任立群 88 如以对数剂量为横坐标 纵坐标改为累积死亡率 则可得S形曲线 1 S形曲线由常态分布曲线累积而来 当剂量被转换为对数值 X 后 反应几率 P 与X遵循常态分布 2 S形曲线是向心对称的 对称中心的纵坐标为50 死亡率 横坐标为1ogLD50 3 S形曲线的两端平坦 中间较斜 由此可知剂量略有变化时LD50附近的死亡率变化很大 两端 LD5或LD95附近 则变化很小 说明 2020 2 23 任立群 90 1 该S形曲线由常态分布曲线累积而来 当剂量被转换为对数值 X 后 反应几率 P 与X遵循常态分布 2 该S形曲线是向心对称的 对称中心的纵坐标为50 死亡率 横坐标为1ogLD50 3 该S形曲线的两端平坦 中间较斜 由此可知剂量略有变化时LD50附近的死亡率变化很大 两端 LD5或LD95附近 则变化很小 4 Bliss根据常态累积曲线的特点列出了死亡率各点的 权重系数 作为权衡各点重要性的定量数值 2020 2 23 任立群 91 4 剂量对数值与几率单位之间呈直线关系 一 LD50的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 其量 效关系应符合以下规律 4 剂量对数值与几率单位之间呈直线关系 几率单位与对数剂量的关系 一 LD50的统计学原理 致死性反应是一种质反应过程 其量 效关系应符合以下规律 根据常态曲线中的均数 标准差与曲线面积下面积的关系 即在该分布曲线下 如把使一半受试个体出现反应的剂量作为中位数剂量 并以此为标准划分若干个标准差 则在其两侧1个 2个或3个标准差范围内分别包括了受试总体的68 3 95 5 和99 7 将各标准差的数值均加上5即为概率单位 Bliss 概率单位与反应率之间的对应关系反应率 概率单位0 122 3315 9450 0584 1697 7799 98 1 剂量与死亡率之间呈偏态分布曲线关系 2 剂量对数值与死亡率之间呈常态分布曲线关系 3 剂量对数值与累积死亡率之间呈S形曲线关系 4 剂量对数值与几率单位之间呈直线关系 2020 2 23 任立群 95 2020 2 23 任立群 96 半数致死量的计算方法 大体上分为三类 插入法 如horn法 面积法 如karber法 几率法 如Bliss几率单位法 简化几率法 Miller和Tainter法 Litehfield和Wileoxon法 二 LD50的计算方法 这些方法各有其优缺点 有的计算简便但结果粗略 有的结果较精确但计算过程繁琐 有的对实验设计要求高 有的应用范围较局限 因而对具体方法的选择应结合工作目的和要求来考虑 我国 新药临床前毒理学研究指导原则 推荐使用Bliss法 1 孙氏改进寇氏法 点斜法 1931年karber提出寇氏原法 1952年Finney得改良寇氏法 1963年孙瑞元进一步改进得孙氏改进寇氏法 以剂量对数取代原法中的一般剂量 根据点斜式直线方程 综合寇氏法及概率单位的优点 优点 计算简便且比较精确 可计算LD50的全部参数 缺点 对实验设计要求比较严格 此法是依据剂量对数与死亡率呈 S 型曲线所包涵的面积推导出死亡率为50 的剂量 1 孙氏改进寇氏法 点斜法 2020 2 23 任立群 100 1 基本要求 反应情况应符合或接近对数正态分布 相邻两剂量的比值应相等 各组动物数相等或相近 一般为10只 不要求死亡率一定包括0 与100 但二者之和最好在80 120 范围内 2020 2 23 任立群 101 2 计算公式 当最小剂量组的死亡率为0 最大剂量组的死亡率为100 时 按下列公式计算 LD50 lg 1 Xm i P 0 5 1 式中Xm为最大剂量的对数 p为各组动物的死亡率 以小数表示 P为各组动物死亡率的总和 P1十P P3 i为组间距 相邻两组对数剂量的差值 2020 2 23 任立群 102 当最小剂量组的死亡率大于0 而又小于30 或最大剂量组的死亡率小于100 而又大于70 时 按下列校正公式计算 式中Pm为最大剂量组的死亡率 Pn为最小剂量组的死亡率 2020 2 23 任立群 103 LD50的标准误差按下式计算 式中Sx50为lgLD50的标准误差 X50即lgLD50 n为每组动物数 2020 2 23 任立群 104 LD50的95 可信限按下式计算 95 可信限 lg 1 X50士1 96Sx50 4 2 Bliss法 利用对数剂量与反应百分率的转换数 几率单位 呈直线关系而设计 又称之为加权几率单位法或几率单位正规法 1 可求LD5 LD95 2 对实验设计要求不严 剂量任意 各剂量组间以是等比级数 也可为等差或不等距的数值 只须有死亡率在50 以上及以下组出现 3 数理严谨 结果精确 优点 缺点 1 计算繁琐 2 须用权重表 2020 2 23 任立群 107 四 对LD50的评价 1 在一定试验条件下测得的LD50值可以提供药物毒性程度更有价值的信息 1 剂量对数 效应曲线 直线 对数剂量 反应曲线的斜率在评价药物的急性毒性中往往比LD50更有价值甚至更为关键 因为它可揭示剂量变化与致死反应之间的关系 提供更为深入的内在毒性特征 有时还能引出毒性作用机制的线索 2020 2 23 任立群 108 斜率的大小可反应毒性反应性质 毒性作用出现情况 在比较同系列化合物时更为重要 两个药物可能有一个完全相同或相近的LD50值 但斜率却可以不同 因此 在相同的剂量范围内 表现出不同的毒理学特征 四 对LD50的评价 1 剂量对数 效应曲线 直线 2020 2 23 任立群 109 具有相同LD50的A药与B药 A药的斜线较B药的斜率大 表明其毒性反应性质较严重 毒性作用出现得迅速或吸收速率较大 较平坦的则反映了安全范围较大 A B两种药物毒效应量 效关系比较 2020 2 23 任立群 110 斜率的大小可反应毒性反应性质 毒性作用出现情况 在比较同系列化合物时更为重要 两个药物可能有一个完全相同或相近的LD50值 但斜率却可以不同 因此 在相同的剂量范围内 表现出不同的毒理学特征 而具平行量 效曲线的两药尽管LD50不同 但却可能表现出相近的毒性作用机制 药动学特征和相似的预后 四 对LD50的评价 1 剂量对数 效应曲线 直线 2020 2 23 任立群 111 不同药物毒效应量 效关系比较 具平行量 效曲线的A C两药 尽管LD50不同 但却可能表现出相近的毒性作用机制 药动学特征和相似的预后 2020 2 23 任立群 112 依据斜率 常可将反应外推至低剂量范围 求算出LD1 LD10 甚至推测出不能观察到的效应水平 四 对LD50的评价 1 剂量对数 效应曲线 直线 2020 2 23 任立群 113 四 对LD50的评价 1 在一定试验条件下测得的LD50值可以提供药物毒性程度更有价值的信息 2 计算急性毒作用带 治疗指数等参数 1 剂量对数 效应曲线 直线 2020 2 23 任立群 114 四 对LD50的评价 1 在一定试验条件下测得的LD50值可以提供药物毒性程度更有价值的信息 2 LD50测定的不足之处 2020 2 23 任立群 115 1 动物消耗量大 获得的信息有限 2 LD50非恒定数值 影响LD50值的因素较多 尽管使用相同数目的试验动物 不同实验室之间所得的数值也很难相似 3 从安全性评价角度来讲 需要的不是精确的LD50值 而是动物出现的毒性和剂量间的量效关系 四 对LD50的评价 2 LD50测定的不足之处 2020 2 23 任立群 116 第三节 急性毒性实验中其他常用试验方法 一 最大给药量法测定 二 近似致死剂量法测定 三 固定剂量法测定 四 上下法测定 五 累积剂量设计法测定 一 最大给药量法测定 对于毒性低的药物 可用最大给药浓度和最大给药容量单次或24小时内分次给药 一般使用20只啮齿类动物 连续观察7 14天 如无死亡出现 则该剂量即为药物的最大耐受剂量 MTD 报告 如无任何动物死亡 则MTD Xg kg 如有个别动物死亡 则LD50 Xg kg 二 近似致死剂量法测定 非啮齿类动物的急性近似致死量及最大耐受量测定 指药物在最低剂量组的一群实验动物中仅引起个别动物死亡的剂量 在急性毒性试验中可表示为LD10或LD5 近似致死量 ALD 指试验中引起一群实验动物死亡的大致剂量或浓度范围 是介于最小致死量与最大非致死量之间的剂量 最小致死量 MLD 2020 2 23 任立群 120 最大耐受剂量 MTD 指实验中动物不引起死亡的最大剂量或浓度 表示为LD0或LC0 最大非致死量 MNLD 指药物不引起实验动物死亡的最大剂量 是急性毒性试验中以死亡为毒效应时的一种最大耐受量 表示为LD0 2020 2 23 任立群 121 MLD MNLD ALD及MTD均可从啮齿类动物急性毒剂量 反应 死亡 曲线上推算得到 新药审批 以非啮齿类动物 犬的急性毒性试验来获得这些数据 实际工作 一般用6只健康的Beagle犬 年龄为6 8月龄 1 估计对狗可能的急性毒性剂量范围 2 按50 递增法 设计出含数个剂量的剂量序列表 4 找到最低致死剂量和最高非致死剂量 用二者之间的剂量给一只动物 5 找到近似致死量范围和最大耐受量 3 根据急性毒性资料估计 由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围 每间隔一个剂量给一只动物 固定剂量的预试验 正式试验 三 固定剂量法测定 1984年英国毒理学会提出 不以死亡作为观察终点 而是以明显的毒性体征作为终点进行评价 固定剂量的预试验 5 50 500 2000 或5000 mg kg正式试验 三 固定剂量法测定 1984年英国毒理学会提出 不以死亡作为观察终点 而是以明显的毒性体征作为终点进行评价 初始剂量 一只雌性大鼠 每个剂量试验之间至少应间隔24h 给受试物后的观察期至少7d 如动物的毒性反应到第7天仍然存在 尚应继续观察7d 固定剂量的预试验 5 50 500 2000 或5000 mg kg正式试验 三 固定剂量法测定 1984年英国毒理学会提出 不以死亡作为观察终点 而是以明显的毒性体征作为终点进行评价 初始剂量 一只雌性大鼠 每个剂量至少用10只动物 雌雄各半 根据预试验结果 在上述4种剂量中选择一个可能产生明显毒性 但又不能引起死亡的剂量进行试验 给予受试物后至少应观察2周 正式试验的结果评价 优点 节省实验动物观察毒性表现估算LD50及其可信限 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 限度试验 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 主试验 限度试验 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 未知药物 初步判定药物的毒性大小 已知药物 LD50 2000mg kg LD50 2000mg kg 限度试验 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 未知药物 初步判定药物的毒性大小 已知药物 LD50 2000mg kg LD50 2000mg kg 限度试验 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 未知药物 初步判定药物的毒性大小 已知药物 LD50 2000mg kg LD50 2000mg kg 主试验 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 限度试验 2000mg kg 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 限度试验 可能出现3种情况 1 第一只动物立即死亡 进入主试验 2 后期 第四天 如出现一只动物死亡 停止下一只动物的给药 可能是第4只或第5只 观察 3 无死亡现象发生 5只动物均接受受试药 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 限度试验 结果评价 1 3只动物死亡时 说明LD50 2000mg kg 需进行主试验 2 3只动物存活时 说明LD50 2000mg kg 无需进行主试验 四 上下法测定 阶梯法 序贯法 主试验 1 n只动物 间隔48h逐一给药 2 确定首次给药剂量 低于LD50