「蛋白酶测定方法」.doc

蛋白酶活性测定方法一 蛋白酶活力单位定义1g 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1g酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。二 测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。三 应用范围本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。四 测定条件4.1 底物： 酪蛋白4.2 pH： 3.004.3 温度： 400.54.4 保温时间： 10min五 仪器5.1 紫外分光光度计5.2 超级恒温水浴 400.25.3 秒表5.4 分析天平：感量0.0001g六 试剂和溶液6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。6.1.3 三氯乙酸c(CCI3COOH)=0.4 mol/L称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按 GB 601配制。6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L按 GB 601配制。6.1.6 缓冲溶液a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HP0412H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO42H20)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸(80%90%)10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08 g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000 mL,上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。6.1.7 l0 g/L酪素溶液称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注:3 )酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。6.1.8 l00g/mL L-酪氨酸4)标准溶液a. 称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，精确至0.0002 g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。注:4 )L-酪氨酸采用上侮长江生化制药厂产品。b. 吸取 1 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.l mol/L盐酸定容至100mL，即得到100 g/mLL-酪氨酸标准溶液。七 分析步骤7.1标准曲线的绘制（求K值）按下表1配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算K值，(其K值应在130135范围内)。管号取100g/mL酪氨酸标准溶液体积mL取水体积mL 酪氨酸标准溶液浓度g/m L0010011910228203373044640555507.2 待测酶液的制备称取酶粉12g，精确至0.0002 g(或吸取液体酶1.00 mL) ，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解、捣研34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.250.40范围内)测定酶粉时稀释倍数参考下表 (液体酶亦可参照下表稀释)。酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释25万20001g200mL(200倍)10mL100mL(10倍)810万40001g200mL(200倍)5mL100mL(20倍)7.3测定测定操作按下列所示反应顺序样品管空白管1加入待测酶液2.0 mL2.0 mL2（预热2分钟）3反应底物预热3分钟4加入底物溶液2.0mL2.0mL(第二步)5混匀640水解10min7加入三氯乙酸终止液4.0mL4.0mL(第一步)8混匀9静止10分钟10.过滤总体积8.0mL8.0mL滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10 mm比色皿，测定其吸光度(A)。7.4 计算X =AK8/21/10nE=2/5AKnE/m式中：X样品的酶活力，u/g(u/mL)；A试样溶液的平均吸光度；K吸光常数；8反应试剂的总体积，mL；2吸取酶液2.00 mL，以1mL计；1/10