核酸提取和注意事项

学习汇报核酸提取的原理及方法 汇报人 富贵青海大学2010级研究生 前言 核酸是遗传信息的载体 是最重要的生物信息分子 是分子生物学研究的主要对象 因此 核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要 最基本的操作 核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取琼脂糖凝胶电泳 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3 5 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子 包括核糖核酸 RNA 和脱氧核糖核酸 DNA 两类 DNA主要储存遗传信息 RNA主要传递遗传信息 核酸简介 质粒 Plasmid 是一种染色体外的稳定遗传因子 大小从1 200kb不等 为双链 闭环的DNA分子 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中 质粒主要发现于细菌 放线菌和真菌等细胞中 它具有自主复制和转录能力 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 并表达所携带的遗传信息 核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取 基因组DNA提取的几种常用方法 CTAB法SDS法其他方法 基因组DNA提取 CTAB法 CTAB法原理 植物DNA提取经典方法 CTAB hexadecyltrimethylammoniumbromide 十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子去污剂 可溶解细胞膜 并与核酸形成复合物 该复合物在高盐溶液中 0 7mol LNaCl 是可溶的 通过有机溶剂抽提 去除蛋白 多糖 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 基因组DNA提取 CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris HCl pH8 0 提供一个缓冲环境 防止核酸被破坏 EDTA螯合Mg2 或Mn2 离子 抑制DNase活性 NaCl提供一个高盐环境 使DNP充分溶解 存在于液中 CTAB溶解细胞膜 并结合核酸 使核酸便于分离 巯基乙醇是抗氧化剂 有效地防止酚氧化成醌 避免褐变 使酚容易去除 基因组DNA提取 CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP 聚乙烯吡咯烷酮 是酚的络合物 能与多酚形成一种不溶的络合物质 有效去除多酚 减少DNA中酚的污染 同时它也能和多糖结合 有效去除多糖 基因组DNA提取 CTAB法 CTAB法实验流程 基因组DNA提取 SDS法 SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂 在高温 55 65 条件下能裂解细胞 使染色体离析 蛋白变性 释放出核酸 提高盐 KAc或NH4Ac 浓度并降低温度 冰浴 使蛋白质及多糖杂质沉淀 离心后除去沉淀 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提 反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取 如动物组织 细胞 全血 细菌 酵母等 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖凝胶作为支持物 利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应 达到分离混合物的目的 小鼠gDNA电泳图 基因组DNA提取常见问题 DNA样品不纯 抑制后续酶解和PCR反应DNA降解DNA量少 基因组DNA提取常见问题分析 DNA样品不纯 抑制后续酶解和PCR反应DNA中含有蛋白 多糖 多酚类物质 抽提纯化 高盐洗涤DNA在溶解前 有酒精残留 酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀DNA中残留有金属离子 重新70 乙醇漂洗 基因组DNA提取常见问题分析 DNA降解材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈 DNA被机械打断外源核酸酶污染 基因组DNA提取常见问题分析 DNA提取量少实验材料不佳或量少 选取新鲜 幼嫩 材料破壁或裂解不充分 充分研磨 破壁酶 延长裂解时间沉淀不完全 低温 延长沉淀时间洗涤使得丢失DNA 核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取琼脂糖凝胶电泳 质粒DNA提取 质粒DNA提取的方法 碱裂解法煮沸法 质粒DNA提取 碱裂解法原理 离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理 离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的SDS 碱裂解法裂解细胞 离心吸附柱内的硅基质膜在高盐 低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA 再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除 最后用低盐 高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱 质粒DNA提取及检测 实验准备 1 实验器材台式高速离心机 旋涡混合仪 移液器 定时器 marker笔 电子天平 电泳设备 凝胶成像系统 微波炉 量筒 试剂瓶 锥形瓶等 2 实验耗材无菌2mL 1 5mLEP管 各规格Tip 一次性手套等 3 实验试剂质粒小提试剂盒 离心柱型 YRBIO LB培养基 抗生素 琼脂糖 DNALoadingBuffer GoldView核酸染料 TAE电泳缓冲液等 4 实验材料对数期菌株 pEGFP N1inDH5 质粒DNA提取 碱裂解法 碱裂解法试剂配方 质粒DNA提取 实验流程 质粒DNA提取 电泳检测 琼脂糖凝胶电泳检测 质粒DNA的三种带型 1 共价闭合环状DNA分子 质粒双链没有断裂 超螺旋结构 泳动速度最快 2 半开环质粒DNA分子 质粒的一条链断裂 松弛的环状分子 泳动速度最慢 3 线性DNA分子 质粒的两条链均断裂 泳动速度居中 质粒DNA提取常见问题 RNA残留质粒断裂量少 质粒DNA提取常见问题分析 RNA残留忘记加RNaseA I液中RNaseA失效 酶量不够 质粒断裂II液裂解时间过长 裂解时动作过于剧烈 质粒DNA提取常见问题分析 量少凝胶是否有问题 菌体量少菌体重悬不彻底裂解不完全菌株老化严谨型质粒 质粒类型 严谨型 这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的 与寄主细胞的复制偶联同步 所以 往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝 松驰型 这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的 每个细胞中含有10 200份拷贝 如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份 如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒 要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数 核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取琼脂糖凝胶电泳 总RNA提取 通用方法 异硫氰酸胍 苯酚法 TRIzol法 原理 核酸在中性条件下 因磷酸基解离而带负电荷 这一部分由于水化而溶于水 而在酸性条件下 磷酸基的负电荷消失 水溶性下降 因此 在酸性酚的处理下 DNA向疏水性的酚层移动 而RNA由于有 OH的存在有亲水性 因此向水层移动 TRIzol试剂 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚 其中异硫氰酸胍可裂解细胞 促使核蛋白体的解离 使RNA与蛋白质分离 并将RNA释放到溶液中 当加入氯仿时 它可抽提酸性的苯酚 而酸性苯酚可促使RNA进入水相 离心后可形成水相层和有机层 这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开 水相层主要为RNA 有机层主要为DNA和蛋白质 总RNA提取 样本准备 植物 动物组织样本 新鲜取材或组织离体后液氮速冻 存于液氮或 80 为避免反复冻融 需小份分装 50 100mg 份 细胞样本 新鲜收集待用或加入TRIzol后 80 冻存细胞沉淀 血液样本 新鲜血液分离出淋巴细胞 待用或加入TRIzol后 80 冻存细胞沉淀 真核细胞总RNA提取 实验步骤 收集细胞 离心洗涤 裂解变性 异丙醇沉淀 抽提 RNA溶液 干燥溶解 293细胞样品为例 上层溶液 RNA提取常见问题 RNA降解DNA残留OD260 OD280比值偏低电泳带型异常 RNA降解外源RNase的污染裂解液质量裂解液用量不足样品本身富含RNase环境温度过高 RNA提取常见问题分析 DNA残留样本量过多吸取到中间层及下层试剂解决办法 DNA酶 RNasefree 消化 再抽提纯化处理 OD260 OD280比值偏低蛋白污染 苯酚残留 加入氯仿后彻底混匀 并且离心分层的离心力和时间要足够 不要吸入中间层及有机相 宁愿多损失些上清 减少起始样品量 确保裂解完全 彻底 解决办法 重新抽提一次 再沉淀 溶解 RNA提取常见问题分析 电泳带型异常上样量超过3 g电压超过8V cm电泳缓冲液陈旧均可能导致28S和18S条带分不开 核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳 1原理 DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 而琼脂糖凝胶具有分子筛作用 不同分子量或分子形状的核酸 其移动速度有差异 因此 利用这种 电荷 和 分子筛 的双重效应 达到分离核酸的目的 DNA的琼脂糖凝胶电泳 2 琼脂糖凝胶分离DNA的范围 DNA的琼脂糖凝胶电泳 3 DNA染料A EB溴化乙锭 EthidiumBromide EB 可以嵌入核酸双链的碱基对之间 在紫外线激发下 发出红色荧光 EB染料优点 染色操作简便 快速 室温下15 20min 不会使核酸断裂 灵敏度高 10ng或更少的DNA即可检出 可以直接加到样品中或胶中 价格低廉 EB是诱变剂 使用时一定要戴手套 EB废液要经过处理才能丢弃 肉眼观察EB染色的DNA B 新型低毒染料 如GoldView SYBRGreen SYBRGold等 毒性较低 但价格较昂贵 灵敏度较好 但不如EB DNA的琼脂糖凝胶电泳 4 琼脂糖胶液制备 1 50ml 4 1称取0 5g琼脂糖 置于250ml锥形瓶中 加入60ml1 TAE电泳缓冲液 微波炉中加热 使琼脂糖溶解 一般需反复煮沸3次 琼脂糖才能充分溶解 加热过程中要不时摇动 使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液 加热时应盖上封口膜 以减少水分蒸发 4 2待胶液冷却至60 左右时 加入5 的GoldView染料 混匀 既成琼脂糖胶液 DNA的琼脂糖凝胶电泳 7