产脂肪酶真菌的筛选.doc

脂肪酶产生细菌的筛选巩素绢（河北农业大学 生命科学学院 微生物与生化药学， 河北 保定 071001）摘要：从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。本试验从保定市炼油厂附近土样中，经富集培养、平板筛选得到22 株脂肪酶产生菌株，通过复筛得到 1 株脂肪酶活力较高真菌。为脂肪酶产生菌以及脂肪酶的工业化生产与应用奠定了基础。关键词：脂肪酶； 筛选；真菌Abstract： The study aimed to seek for the fungi with high yield of lipase from the greasy soil，so as to provide the material for expanding the fungi source of lipase. 22 strains of fungi producing lipase were isolated by enrichment culture and flat screening methods in soil samples collected from the refinery of Baoding A stain with higher activity of producing lipase was isolated by re-screening methods.The study laid a foundation for lipase producing bacteria and industrial production and application of lipase to some extentKey words:Lipase; Screening; fungi前言脂肪酶( Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶) ，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸1。微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的 pH 和温度范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂2。脂肪酶在微生物界分布很广，据不完全统计，目前已有 65 个属的微生物能够产生脂肪酶3。随着对微生物脂肪酶研究的深入，已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景4。就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已进行了多年研究，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难和应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多5。国内，脂肪酶的研究与开发曾被连续列为 3 个“五年”攻关项目，但目前对脂肪酶制剂的需求仍主要依赖进口6。因此，该研究拟通过初筛和复筛从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。1 材料与方法1.1 样 品1.1.1供试土样8个土样分别采自保定市周边植物油厂、餐厅、菜市场、屠宰场等周围富含油脂的土壤。1.1.2 试 剂聚乙烯醇（PVA，聚合度175050）购自天津市化学试剂三厂；橄榄油购自上海医药（集团）上海化学试剂公司；其他生化试剂或化学试剂均为进口或国产分析纯。1.1.3 培养基富集培养基：每升含0.5g (NH4)2SO4，0.1g NH4NO3，0.1g NaCl，0.1g MgSO47H2O，0.5g K2HPO4，0.1g FeSO47H2O，10mL橄榄油，用0.1mol/L NaOH 调pH8.0。初筛培养基：每升含0.5g (NH4)2SO4，0.1gNH4NO3，0.1gNaCl，0.1g MgSO47H2O，0.5gK2HPO4，0.1g FeSO47H2O，20g琼脂，121灭菌20 min后，于60左右加含0.2%溴甲酚紫的聚乙烯醇橄榄油乳化液12mL。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。PDA 培养基： 马铃薯 200.0 g /L，蔗糖 20.0 g /L，琼脂20.0 g /L。PDB 培养基不添加琼脂。发酵培养基：每升含1.0g (NH4)2SO4，1.0gMgSO47H2O，1.0g NaH2PO4，2.0g K2HPO4，10mL橄榄油，20g黄豆粉，10g蔗糖。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。种子培养基：每升含5.0g (NH4)2SO4，1.0g K2HPO4，0.5g MgSO47H2O，20g 葡萄糖，25g蛋白胨，10mL橄榄油。用0.1mol/L NaOH调pH8.0。1.2 试验方法1.2.1 产脂肪酶菌株的筛选1.2.1.1 富集培养将采集的土样 10 g 溶于 90 mL 蒸馏水中，充分摇匀，取上清液 2 mL 加入到含 20 mL 富集培养基的l00 mL 三角瓶中，30 、200 r /min 振荡培养 2 d。再次取 1 mL富集培养液转接到新的 20 mL 富集培养基中，进行第 2 次富集。共富集3 次。1.2.1.2 平板分离将第 3 次富集培养液采用梯度稀释法稀释后涂布于筛选培养基上，30 恒温培养 72 h，紫外灯下观察所长菌落周围有无荧光圈及荧光圈大小，荧光圈直径/菌落直径( HC 值) 愈大，表示该菌株产脂肪酶能力愈强。每个梯度作3 个平行。将 HC 值较大的菌株用划线分离纯化，纯化后接种于 PDA 斜面4 保藏。1.2.1.3 菌株复筛无菌条件下将筛选菌株接种于发酵培养基上，30 振荡培养48 h。发酵液6 000 r/min 离心，上清液即为粗酶液。利用平板扩散法测定粗酶液酶活，比较酶活力的大小，最终获得产酶能力较高的菌株，并斜面保存。1.2.1.4 平板扩散法测定脂肪酶酶活配制溴甲酚紫显色培养基并倒平板。冷却凝固后，利用无菌打孔器在平板上打孔，孔径08 cm。取粗酶液01 mL注入孔中。每个显色平板作2 个平行。将平板置于30 条件下反应12 h 后观察变色圈大小，判断粗酶液的酶活大小。2 结果与分析2 1 脂肪酶产生菌株的筛选2 1 1 选择平板初筛用溴甲酚紫平板对土样进行初筛，获得 22 株产脂肪酶菌株( 表 1) ，发现 5、7、16 和 18 号菌株HC 值1 5，产酶能力较高，因此对这 4 株菌株进行复筛。表1 菌株初筛、复筛结果Table 1 Screening and rescreening results of strains序号NoHC 值 HC value初筛Screening复筛Rescreening11.221.331.341.251.71.661.471.61.581.391.2101.3111.4121.3131.1141.4151.4161.51.4171.3181.51.2191.4201.3211.2221.42 1 2 平板扩散法复筛挑取初筛的 4 株菌株，接种于发酵培养基中，30 振荡培养48 h 后，离心得粗酶液，利用平板扩散法测定酶活大小，结果见表1。可以看出，初筛的4 株菌株产脂肪酶能力依次为5 号 7 号 16 号 18 号，因此确定5 号菌株为目的菌株。3 结论从富含油脂土壤中分离得到 1 株产脂肪酶能力较高的菌株，根据菌落及个体形态，查阅相关鉴定手册，初步确定该菌株为黑曲霉。参考文献1胡长浩,施文芳,沈麟,等. 脂肪酶菌种的筛选,鉴定及酶学性质研究J. 生物技术,2009,19(2) :53-57.2董明奇,史岩,姜春雷,等. 脂肪酶高产菌株的筛选及酶学特性研究J.四川大学学报,2008,45(4) :985-990.3JAEGER K,EGGERT T. Lipases for BiotechnologyJ. Current Opinion in Biotechnology,2002,13( 4) : 390-397.4周海霞,袁丽红,欧阳平凯.脂肪酶假单