免疫组化基本技术.ppt

免疫组化基本技术 王海龙2006 03 小鼠小肠肌间神经丛铺片NO合酶免疫酶细胞化学染色 200 CC16蛋白免疫组织化学染色图 免疫组化概述组织细胞的准备 处理及Ag修复免疫组化染色类型及原理免疫组化的操作常规 第一节免疫组化概述 免疫组织化学 Immunohistochemistry IHC 又称免疫细胞化学 它是组织化学的分支 是用标记的特异性抗体 或抗原 对组织内抗原 或抗体 进行组织和细胞原位检测 定性 定位和定量 的技术 一 概念 二 特点或优点 1 特异性强 灵敏度高 2 可定性 定位 定量观察 3 将形态学改变与功能和代谢变化结合起来 1 组织细胞内蛋白的定位 定量 2 用于临床诊断 肿瘤病理学等 大中医院 3 用于科研 临床和基础医学 现在的研究生常用IHC 或IHC 分生技术 三 IHC的应用 第二节免疫组化操作 一 组织细胞的准备 处理 一 标本的收集与处理1 组织标本的取材与储存来源 活检取材 手术切除 实验动物组织等 要求 要快 要小 1 1 0 4cm 避免挤压 处理 冰冻 切片 固定 切片 即用或保存 2 细胞标本的取材与储存来源 血细胞 穿刺细胞 体液细胞等 处理 细胞多时直接涂片 干燥 固定 细胞少需离心沉淀 涂片 干燥 固定 对于体外培养细胞 贴壁生长细胞1 细胞大量培养后 经消化将细胞制成悬液 106 涂在涂有切片粘合剂的载玻片上 凉干后固定 2 将细胞直接培养在盖玻片上 3 将细胞直接培养在6孔或9孔板上 经固定后可行IHC 悬浮生长细胞需离心沉淀 再涂片 固定 即用或冰冻保存 二 固定 fixation 1 固定的含义固定是指以某种化学物质使蛋白质 酶类 变性 脂质 糖类等物质保持在组织细胞原位 避免Ag溶解 扩散 丢失 保持组织细胞的正常形态结构 2 固定剂的分类交联性固定剂甲醛和戊二醛蛋白沉淀性固定剂乙醇 丙酮 3 常用固定剂及其用途 1 10 的formalin2 4 的多聚甲醛3 70 的酒精4 70 丙酮 或纯丙酮 4 固定剂的选择 1 多糖冷的饱和苦味酸 750ml 甲醛 250ml 冰醋酸 50ml 2 核蛋白及核酸醋酸或三氯醋酸 TCA 3 酶丙酮 4 蛋白质10 的formalin或4 的多聚甲醛 5 固定的方法 1 原位固定法 0 4 进行 边取材边固定2 浸泡固定法 常用3 蒸汽固定法 多聚甲醛60 80 4 灌注固定法 肝素缓冲液清洗 固定液固定 缓冲液冲洗 取材 必要时再浸泡固定 分心脏灌注和血管灌注两类 2 细胞固定离心 涂片 固定5 10 漂洗 组化 1 组织固定 三 组织的脱水 浸蜡 包埋和切片前三步只用于石蜡切片 冰冻切片和振动切片不需此步骤 1 包埋定义 脱水透明后 用石蜡 火棉胶 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变硬 利于切片 的过程 石蜡包埋适于绝大多数组织学和组化技术 2 常规石蜡包埋过程 1 脱水 75 85 乙醇 95 乙醇 无水乙醇 2 透明 二甲苯 二甲苯 二甲苯 3 浸蜡 石蜡 石蜡 石蜡 4 石蜡包埋 修蜡块 标号 3 切片石蜡切片 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片5 7 m 冰冻切片 浸糖 20 30 蔗糖4oC过夜 减少冰晶 OCT包埋 液氮速冻 减轻组织破坏 病理切片要薄 5 7 m 脑片通常30 50 m厚 振动切片 不需做任何包埋 固定后的组织可直接用振动切片机做各种厚度的切片 并在染色后可进一步制作电镜标本观察 4 防脱片剂1 1 的铬矾明胶涂片 2 0 1 的多聚赖氨酸涂片 晾干备用 配制时用塑料瓶而不能用玻璃瓶 3 APES 氨丙基三乙氧基硅烷 1 50丙酮稀释 浸片20 30秒 晾干备用 贴片时要一步到位 4 购买商品化的进口硅化玻片 二 切片的免疫组化染色 一 切片脱蜡至水 二甲苯 10min 二甲苯 10min 二甲苯10min 无水乙醇2min 95 乙醇2min 85 乙醇2min 75 乙醇2min 流水冲洗 二 内源性酶的消除方法1 内源性过氧化物酶的消除方法 1 0 3 3 H2O2甲醇液20min2 1 H2O220min3 3 苯肼溶液37 1h4 0 075 盐酸甲醇液30min2 内源性碱性磷酸酶的消除方法1 10 醋酸10min2 0 5mol L碳酸氢钠 pH9 0 20min3 1mol L左旋咪唑20min 3 内源性生物素的消除方法1 先用25 g ml卵白素孵育15min PBS洗10min 移至生物素饱和液中处理15min PBS洗15min 2 用2 甲基 D苷露糖孵育 封闭神经组织中的乳糖 三 抗原修复 1 目的暴露被交联封闭的Ag 主要适用于经长期formalin固定的标本 石蜡包埋标本 也可用于冰冻切片 2 修复液10mM pH6 0的枸橼酸钠缓冲液 3 常用的修复方法有 1 微波加热2 高压锅处理3 酶消化处理 常用0 1 的胰蛋白酶或0 4 胃蛋白酶 四 封闭采用正常二抗来源的动物 羊 血清封闭 以减少一抗非特异性结合 五 一抗4度过夜或37度1 2小时 六 二抗37度20 30分钟 七 显色滴加底物在显微镜下显色 适时终止 八 苏木素复染 盐酸酒精分化 九 脱水 透明 封片 中性树胶 第三节IHC主要染色方法的原理 基本方法荧光素标记抗体 FITC等直接法标记抗体法酶标记抗体 HRP AP等荧光素标记抗体间接法酶标记抗体 三步法 非标记抗体法 酶桥法 PAP法 APAAP法 亲和组化法 ABC法 LAB法 LsAB法 BRAB法 双重标记 阻断法 酸洗 抗 非阻断法 连续染 一 直接法与间接法 直接法特点 1 此法特异性高 但敏感性低 2 每种抗体均需单独标记 使用不便 间接法特点 1 敏感性较直接法高3 4倍 但特异性较低 2 不必标记每种一抗 只需标记某一种动物的二抗 二 亲和素 生物素方法 一 亲和素 生物素 过氧化物酶复合物技术 avidin biotin peroxidasecomplextechnique 简称ABC法 二 酶标亲和素 生物素技术 SP法 酶标链卵白素 SP法 3步完成 三 酶标 生物素 链霉亲和素 生物素技术 SABC法 ABC法 3步完成 四 SP与ABC的差别1 相同点 Avidin和SA均与生物素有高度亲和力 且均有4个生物素结合位点 2 不同点 1 SA分子量小 易穿透组织 可增强敏感性 2 SA不含糖基链 其等电点为6 5 接近中性 所带负电荷少 而Avidin等电点为10 相比之下SA可以减少由于静电吸引导致的非特异性着色 使用SP法可以有低背景 高放大的效果 五 SP与SABC的差别 SP法 一抗 生物素标记二抗 辣根酶标记链霉卵白素 辣根酶底物显色SABC法 一抗 生物素标记二抗 滴加试剂SABC 链霉卵白素 辣根酶标记生物素 辣根酶底物显色 过氧化物酶被生物素标记了 这就使得生物素标记的过氧化物酶分子可作为桥连接于抗生物素分子之间 于是形成了一个含有3个以上过氧化物酶分子的网格状复合物 敏感性大大提高 而SP法由于过氧化物酶没有被生物素标记 形成的复合物就大为逊色 故而敏感性不如SABC法 三 凝集素免疫细胞化学技术 四 双重或多重免疫细胞化学技术 用于在一种细胞或组织标本上同时检测2种或3种抗原 一般均采用直接法 如将三种标记抗体 如抗A 抗B和抗C 按适当比例混合 加在标本上孵育后 按直接法洗去未结合的抗体 如用荧光素标记 可分别以黄绿色荧光 红色荧光和蓝色荧光标记 以明确显示三种抗原的定位 第四节IHC结果的分析 一 前提 阳性对照为阳性 阴性对照为阴性 二 阳性反应 一 阳性反应产物的分布位置和颜色依Ag的位置不同而分布在细胞浆 神经递质等 细胞核 S 100蛋白 细胞膜 表面抗原 及细胞间质 胶原等 处 DAB反应产物为棕色 AP的产物为蓝或红色 二 阳性反应强度IHC宜定性 定位 定量的准确性差 一般可做半定量 即以弱阳性 阳性 强阳性 形式来记录 三 阳性反应程度以阳性细胞所占百分率来表示 即阳性细胞在25 以下为 25 50 为 50 75 为 75 以上为 四 用图象分析仪做定量分析要求实验要标准化阳性单位的使用 下课 休息 附录 1 脂类显色 组织中的脂类 单纯脂类脂肪酸醇的化合物 如 甘油三脂等 复合脂类磷脂 卵磷脂 脑磷脂 鞘磷脂糖脂 脑苷脂 神经苷脂 衍生脂类胆固醇肾上腺素性激素 显示脂类的基本原理 用易溶于脂类的染料 使之溶于所检的脂质 如脂滴 中 使组织内的脂类着色 常用方法 苏丹黑B法 油红O法 硫酸尼罗蓝法 基本要求 不用石蜡切片 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好 方法 物理法 脂溶性染料 不溶于水 属偶氮染料 常用苏丹 苏丹黑 油红O等 化学方法 硫酸尼罗蓝显示脂肪酸 选择性提取法 对照 实验举例 苏丹黑B法 原理 苏丹黑为偶氮染料 具有脂溶性 可溶于无水酒精 但不溶于水 常用70 酒精饱和液 当组织切片入染液时 苏丹黑B便离开染液而溶于组织内的脂质 如脂滴中 使组织内脂类着色 标本 兔肾上腺和睾丸横冷箱切片 10 m厚 不固定 或用10 Formalin固定10分钟后水洗 方法 入蒸馏水洗 于70 乙醇内涮洗 入苏丹黑B 70 B饱和液 染5 10分钟 于50 酒精内浸洗 蒸馏水中洗 入Mayer苏木精 复染细胞核 1分钟 自来水冲洗5 10分钟 入蒸馏水 甘油明胶 或Apathy糖胶 封固 结果 细胞内脂滴均呈黑色 附录 2 常规石蜡切片 HE染色程序 取材 固定 脱水 升梯度酒精脱水50 70 80 90 95 100 3 4h1 5h 透明 用二甲苯 观察组织块至透明为止 0 5 1h 共两次 浸蜡 一般用两个蜡缸 石蜡 60 1h 石蜡 60 2h 包埋 铁板架包埋或其他容器 有时要求快速冷却 切片和贴片 在切片机上切片 置水槽中展片 捞片和贴片 染色 HE染色步骤 1