酶法分析ppt课件

第8章酶在食品分析中的应用 前言概念 优点 局限性8 1酶法测定的基本原理8 2酶法分析技术8 3酶指示剂分析食品热烫和灭菌效果8 4固定化酶和酶电极 酶法分析的概念 优点 局限性 酶分析的概念 酶分析就是通过对酶反应的测定来达到化学分析和临床检定目的的一类分析方法 以酶为分析对象的分析 称为酶活力的测定 以酶为分析工具的分析 称为酶法分析 它分为两种类型 酶法分析可测定化学分析无法分析的内容 被测样品无需预先提取分离 不破坏被测物质 为什么 专一性 为什么 常温 高效 温和 为什么 酶的广泛分布 种类多 酶法分析的优点 需要有适宜的 高纯度的 高比活力的工具酶 因而代价较高 工具酶在酶法分析中只起一种温和而专一的预处理作用 最终测定仍需采用化学方法或物理化学方法 酶法分析的局限性 酶法测定的基本原理 1 CA CB和CC3个底物浓度对吸光度变化的影响 吸光度最初变化快 以致反应在几分钟内即可完成 此方法仅需知道最初和最终吸光度 2 根据 1 中的数据 得到底物浓度和吸光度总变化的相关图 下图是根据反应前后酶反应体系的吸光度或荧光强度的总变化 测定产物 或底物 的量 终点法的优点 不必控制影响酶反应初速度的pH和温度等许多参数 而只需要保证酶反应进行完全 例如 在乳酸脱氢酶催化反应中 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH一种方法可以加入过量的反应物NAD P 通常是使它的浓度达到被测组分的浓度的5至10倍 另一种方法 可以加入肼除去产物丙酮酸 使反应向产物方向进行 另外 可以在完全相同的反应条件下 制作标准曲线 然后通过标准曲线得到待测化合物的浓度 食品酶学分析中采用终点法所需要的某些酶的浓度 在某些情况下 酶催化反应不能进行完全就已达到平衡 此时可以通过提高反应物浓度或去除反应的某一产物 从而打破平衡 使其向有利于产物的方向进行 8 1 2动力学测定法 根据测量转化速率 以得到底物浓度 测定的参数可以是吸光度 荧光度 p 值等 初速度V0和底物的原始浓度 S0 不是线性的 而是一条曲线 以1 V0对1 S0 作图制作标准曲线 然后从标准曲线测定待测物浓度 测定速度快 试剂用量少 成本低 对浊度和色素的干扰不敏感 不需要考虑反应是否进行完全 有利于自动分析 对裂解酶和异构酶特别适宜 当水含量保持不变时 水解酶催化的水解反应也可以认为是单底物反应 该方法特点 该方法不足 对反应的条件 如酶浓度 pH和温度 要求严格 待测物的测定和标准曲线制作的条件要求完全相同 要求分析使用的酶具有高的Km 以便测定较高的底物浓度 准确度相对较差 8 1 3被测化合物是酶的辅因子或抑制剂 如果待测物质可作为某种酶专一的辅酶或抑制剂 则这种物质的浓度和将其作为辅酶或抑制剂的酶的反应速度之间有一定关联 因此通过测定该酶的反应速度就能进行这种物质的定量 此法可用于嘌呤 核苷酸 维生素 辅酶和食品中农药 杀虫剂的检测 同样 利用那些活性金属离子决定的酶也可进行相应无机金属离子的检定 辅酶或抑制剂待测物质产物 酶 例如 利用有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶 acetychdineEsterase 的特异性抑制作用 目前已广泛应用酶化学分析方法测定痕量和微量有机磷及氨基甲酸酯类的残留 乙酰胆碱酯酶可以催化乙酰胆碱 且同时它也可以催化水解其他一些羧酸酯 产生色差反应 当农药抑制了胆碱酯酶 则反应不能进行 乙酰胆碱有色物质 有机磷及氨基甲酸酯类农药 乙酰胆碱酯酶 抑制 1 以碘代硫化乙酰胆碱作为底物 5 5 二硫代2 2 二硝基苯甲酸 DTNB 作为显色剂 碘代硫化乙酰胆碱碘代硫化胆碱乙酰胆碱酯酶有机磷农药5 巯基 硝基苯甲酸于410nm波长处测定溶液的吸光度变化 黄色 DTNB 通过比较特定的酶催化显色反应动力学曲线 直接显示有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱的抑制率 并以其来反映样品受农药污染的程度 现已有依据这一原理研制出便携式残留毒性快速测定仪 敌敌畏的检出限为2 2 10 5ug ml 此方法可以对大量农产品中农药残留超标或不超标进行快速筛选 亦可进行农药残留的定量分析 2 氯化乙酰胆碱 胆碱酯酶 醋酸 有机磷农药 氯化乙酰胆碱 pH指示剂 定性或半定量分析 3 植物酯酶水解2 6 二氯乙酰锭酚 植物酯酶促使底物2 6 二氯乙酰锭酚分解 根据反应溶液水解前后颜色的变化 通过辨别农药对酶抑制程度 间接观察农残情况 有机磷农药 此法操作简单 测定快速 很适合于水中和市售新鲜蔬菜进行农残快速检测 检测限在0 029mg L 10mg L 4 选用乙酸萘酯作为底物 a 乙酸萘酯 水萘酚 乙酸固蓝B显色产物在680nm波长处测定吸光度 检出限在mg kg级别 不可检出氨基甲酸酯类农药 有机磷农药 胆碱酯酶 酶法分析技术的种类及其基本原理 龙肇 马硕 8 2酶法分析技术 8 2 1多酶偶联测定法8 2 2通过酶反应循环系统的高灵敏度测定法8 2 3放射性同位素测定法8 2 4酶标免疫检测法8 2 5酶联免疫吸附检测法 8 2 1多酶偶联测定法 当被分析的底物或反应产物没有易于检测的常规手段时 可采用两种或两种以上的酶进行连续式或平行式的偶联反应 使底物通过两步或多步反应 转化为易于检测的产物 从而测定待测物质的含量 偶联的酶主要有脱氢酶和氧化酶 其中应用最广泛的是以 辅酶 或 辅酶 为辅酶的脱氢酶类 例1 葡萄糖的定量测定 己糖激酶葡萄糖 ATP葡萄糖 6 磷酸 ADP葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 NADP6 磷酸葡萄糖d内脂 NADPH H 若将以上两个酶反应偶联 则葡萄糖的减少量与NADPH的生成量成一定比例 NADPH在340nm波长处有特征最大吸收峰 而NADP则无光吸收 因此 通过测定340nm波长处吸光度的变化 就可以对葡萄糖进行定量分析 该法的原理是 SOD亚硫酸盐氧化酶 存84天 8 2 2通过酶反应循环系统的高灵敏度测定法 A BC DA YC X如果待测底物 的量极微 无法直接测定时 可将以上两式偶联 构成一个酶反应循环系统 将 的产物 再变成 如此经过多次循环 产物 的量将随反应时间不断积累而增多 如果选择适当的反应条件 在一定时间后使循环反应停止时 的生成量将与被测物质 的最初浓度成比例 对于不能直接测量的微量物质 经过循环反应后 通过测量 就能定量微量的 8 2 3放射性同位素测定法 酶的活性可以采用同位素标记的底物进行测量 经酶解后产生放射性的产物 随时间所生成的放射性产物含量与酶的浓度成正比 此外 用放射性同位素的底物经酶的作用后得到的产物 经适当分离测定产物的同位素含量 此法可用于需要进行极微量的分析或因新发现的酶还未找到适当的分析法时的测定 用于测定的放射性同位素一般有3 14 32 35 8 2 4酶标免疫检测法 抗体与相应的抗原具有选择和结合的双重功能 通过测定复合物中酶的含量可得出待测抗原的含量 酶标免疫检测法可用于食品的污染检测中 尤其适用于毒素的快速检测 酶 抗体 酶标抗体 待测抗原 酶 抗体 抗原复合物 8 2 5酶联免疫吸附检测法 酶联免疫吸附检测法 Enzyme LinkedlmmunosorbentAssay简称ELISA 是将酶分子与抗体分子连接成一个酶标分子 当它与固相免疫吸附中相应抗原或抗体复合物相遇时形成酶 抗原 抗体结合物 加入酶底物 底物被催化成可溶性或不溶性显色产物 可用肉眼或分光光度计定性或定量 这对酶标记抗体技术是一个发展 酶联免疫吸附测定法主要针对小分子量 2500 的农药 因为大分子量的农药可以直接作为抗原免疫动物产生抗体 小分子量的泻药属于半抗原 一般不具有免疫动物产生抗体 因而要与分子量大的载体偶联 制备人工抗原 以人工抗原的形式贸易商动物产生抗体 8 2 5 1酶联免疫吸附的原理与方法 固相载体上酶标抗原或抗体被结合量 免疫复合物 即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例 含抗体或抗原 酶标抗原 或抗体 固相载体 免疫复合物 待测样品 原理 酶反应底物 有色产物 经洗涤去除反应液中其他物质 通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量 ELISA常用的测定方法 直接法和间接法两种 直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用 加入底物后 显色 其颜色深浅与样本中抗原量成正比 间接法是使已知抗原吸附在固相载体上 与待检测样本中的抗体作用 再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白 抗抗体 使与特异抗原抗体复合物中的抗体作用 加入酶底物 显色 颜色深浅与样本中抗体量成正比 本法具有可定量 反应灵敏准确 标记物稳定 适用范围宽 检测速度快以及费用低等特点 近年本技术得到了快速的发展 特别是广泛应用在快速检测上 8 2 5 2ELISA在食品中检测的应用 1 检测食品中的毒素 2 检测食品中的残留农药 3 检测食品中的微生物 4 检测食品中的其它成分 1 检测食品中的毒素 目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种以上 常见的产毒性真菌有曲霉菌属 青霉菌属 镰刀菌属等 其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒素 超曲霉毒素等 例如有报道利用免疫吸附方法测定酱油中黄曲霉毒素 1 过去多以限量法 指标仅限于小于 等于5ug kg 对于超过此值的样品 需作确证试验 手续更为繁杂 且不能准确定量 按ELISA法可大大提高样品阳性检出率 在扫描仪上可直接测出数据 检测罂粟壳等毒品 目前 市场上出现了在食品中渗入罂粟壳等毒品 而现有方法如比色法 极谱法 色谱法和免疫分析法无法有效监测样品 而酶联免疫测定方法灵敏度高 特异性强 操作方便 能快速监测 利用酶联免疫测定法测定 最小检出浓度为5 0ng mL 具有十分明显的社会和经济效益 2 检测食品中的残留农药 近年来 各国对氯霉素残留量的最大允许限量 日趋苛刻 如 欧盟1mg kg 美国和加拿大0 3mg kg 日本50mg kg 使原有的方法灵敏度不够 已不能适应于当前的检测要求 应用ELISA 氯霉素检测下量达到0 1mg kg 将氯霉素与载体牛丙种球蛋白结合 形成具有免疫原性的完全氯霉素 BGG抗原 并免疫兔三次 一个月后收集兔血清 纯化出抗氯霉素抗体 将辣根过氧化物酶 HRPO 与氯霉素抗体 CAP 结合 形成氯霉素结合体 CAP HRPO 在已固定抗氯霉素抗体的酶标孔内依次加入两份的氯霉素标准溶液和不同浓度的蜂蜜样品 37 反应1h后取出 再加CAP HRPO 37 反应1h后取出 加呈色液 反应5 15min后观察结果并加反应终止液 用酶标仪测定吸光值 美国和加拿大规定蜂蜜中氯霉素的残留量为不大于1mg kg 欧盟则为不大于0 1mg kg 我国尚没有标准 将ELISA方法应用于蜂蜜中氯霉素残留量的检测 其检测灵敏度为0 3mg kg 基本达到国际检测标准要求 原理与方法 氯霉素与载体牛丙种球蛋白结合 将辣根过氧化物酶与氯霉素结合 形成氯霉素结合体 CAP HRPO 竞争性形成 酶标免疫复合物待测物免疫复合物 待测氯霉素 氯霉素 BGG抗原 酶反应底物 有色产物 颜色越深说明酶标免疫复合物相对含量 待测物含量 通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量 通过免疫法获得抗氯霉素抗体并固定 高 低 检测克百威 克百威 Carbfuran 2 3 二氢 2 2 二甲基 7 苯并呋喃基 甲基氨基甲酸酯 商品名呋喃丹 是氨基甲酸酯类杀虫剂的主要品种之一 对人具有很高的毒性 在美国已将其作为饮用水的检测指标之一 规定其最大残留量为0 04mg 用ELISA试剂盒来检测克百威 已有研究报道最低检测限为0 01mg 线性检测范围为0 01 10mg 供试样品检测结果的批内 批间 整体变异系数均低于8 回收率均高于90 符合农药残留分析要求 试剂盒在4 或 20 下至少可保存6个月 用ELISA试剂盒检测杀虫剂克百威残留较常规的仪器分析具有操作简便 灵敏度高 特异性强 快速等特点 并能批量地分析样品 3 检测食品中的微生物 目前 传统的微生物学方法仍然是食品检测中常用的方法 但存在操作繁琐 时间冗长 工作量大等缺点 对大部分微生物来说 用传统方法检测至少需要4 5天时间 有些致病微生物甚至无法进行人工培养 各类肉品易受多种致病微生物的污染 其中 沙门氏菌是人畜共患肠道病原菌和细菌性食物中毒重要病原茵 原有的常规检测方法 存在操作复杂 需要特殊仪器 检测时间长等弊端 利用ELISA检测沙门氏菌 该方法比常规培养法提前3 4天 不需要特殊实验设备 肉眼即可观察结果 且样品易保存 该试验和常规细菌学检验法对200份样品对比检验 该法检出结果符合率为96 65 4 检测食品中的其它成分 免疫球蛋白 Immunoglobulin 简称 指具有抗体活性 能与相应抗原发生特异结合的球蛋白 是构成体液免疫的重要的物质 牛乳中特别是初乳中免疫球蛋白的含量相当高 最近开发的免疫奶 就是通过对乳牛进行免疫注射从而提高牛奶中的免疫球蛋白的含量 再有市场中强化免疫球蛋白的奶粉 口服液等 因免疫球蛋白也是一种蛋白质 具有蛋白质的共性 但其在上述制品中含量又相对的少 常规的蛋白测定法无法测出免疫球蛋白的含量 用ELISA即可成功解决这个问题 且同时可完成含量与活性的检测 ELISA技术还可应用于食品中其它成分的测定 包括抗营养素因子如大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子 食品营养成分如牛初乳中乳铁蛋白含量等 食品加工过程中的酶的含量的变化 检测某些特定的转基因表达蛋白 以分析食品是否来自转基因生物或者含有转基因成分 酶分析食品热烫和灭菌效果 酶电极技术 岳峰 8 3酶指示剂分析食品热烫和灭菌效果 在食品加工过程中 对未加工食品的品质评价 优化特定食品中的加工参数及酶制剂使用之前的分析是很重要的 用酶分析方法就是利用这些食品品质发生变化过程中酶活力会随之变化的原理 用酶法分析法测定酶活力的变化达到测定食品品质的变化值 表8 3评价食品质量的酶指示剂 8 4固定化酶和酶电极 酶在固定化以后 一般比较稳定 因此在分析含有复杂成分的样品如血液和污物时 固定化酶作用更大 如利用胆碱酯酶被有机磷化合物抑制的特性 将胆碱酯酶做成酶片 酶电极应用于各种报警器材中 检测空气 水源 食品的有机磷化合物 再如 利用酶试纸法检测食品硝酸盐含量 通过硝酸盐还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐 再利用已经研制出的亚硝酸盐检测试纸对亚硝酸盐进行检测 硝酸盐还原酶在有辅酶 存在的情况下 在pH值为7 5 温度为37 条件下 可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐 最低检出限以 计为0 2mg 酶电极 如果将固定化酶同具有传感器功能的电极紧密地结合在一起 就构成了酶电极 酶电极是一种检测器 由电极和含有固定化酶的涂层所构成 当待测物扩散到电极表面的酶层时 由于酶的作用产生一种离子选择电极或气体敏感电极能响应的化合物 导致电位或电流的变化 这种变化是待测物浓度的函数 这样 只要将酶电极放到溶液中 就可直接检测待测物的浓度 同时可以省去配制试剂 制作标准曲线等工作 酶电极的使用将反应和检测结合起来 具有快速 方便 灵敏 精确等特点 并使酶法分析自动化成为可能 目前已实际应用于分析中的酶电极有 氨基酸氧化酶电极 过氧化物酶电极 脲酶电极 葡萄糖氧化酶电极等 1 用于检测食品质量的酶传感器 目前 应用酶传感器至少可以检测8种氨基酸和一些糖类物质 如用脲酶电极法测定食品中赖氨酸含量 电流型谷氨酸氧化酶电极和谷氨酸脱羧酶电极都可测定酱油中谷氨酸的浓度 也可应用于味精发酵液中谷氨酸含量测定 日本 加拿大在检测食品鲜度传感器的研究比较深入 目前已研制成功检测肉品新鲜度的生物传感器和食品分析的生物传感器系统 其检测灵敏度高出以前方法的20倍以上 目前 日本 加拿大的公司正在出售检测鱼新鲜度的生物传感器 2 用于检测食品质量的微生物传感器 检测食品质量的微生物传感器主要有 如用玻璃电极将大肠杆菌包在CO2电极上用于测定谷氨酸浓度的传感器 用酵母细胞被固化在乙酰纤维膜上 外层用一层气体可渗透的膜 制成乙醇电极 来检测酒精和其他化学物质的传感器 有较高的选择性和灵敏度 有人将微生物活细胞新陈代谢产生的电子转移转换为传感器的电流输出 并设计 研制了单片计算机控制 带恒温测量池的专用测定仪 还研究了传感器对大肠杆菌 啤酒酵母 霍乱弧菌及卡介菌苗的响应 实际测量了发酵罐中啤酒酵母菌总数及鲜牛奶中的细菌总数 结果分别与显微镜下直接计数法及平板接种24h菌落计数法相吻合 测量时间仅需数分钟 基本做到了现场 实时的测定 3 用于检测食品质量的免疫传感器 根据竞争酶免疫反应原理设计的传感器 如黄曲霉毒素传感器 它是由氧电极和黄曲霉毒素抗体膜组成 将一定量的过氧化物酶标记黄曲霉毒素加到待测样品中 酶标记的及未标记黄曲霉毒素会与膜上的黄曲霉毒素抗体发生竞争反应 测定酶