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更昔洛韦片在健康人体的生物利用度与生物等效性摘 要 :目的 建立测定血浆更昔洛韦浓度的HPLC-UV法并研究更昔洛韦片的生物利用度及其生物等效性。方法 按两制剂双周期自身对照交叉试验设计, 20名男性健康志愿者分别单剂量口服更昔洛韦片(受试制剂)和更昔洛韦片（山东罗欣药业股份有限公司，参比制剂）,用HPLC法测定血药浓度,计算药代动力学参数,并评价两制剂的生物等效性。结果 分析20名健康受试者单次口1000mg的更昔洛韦受试制剂和参比制剂。以药时曲线下面积AUC024计算，更昔洛韦受试制剂与参比制剂比较的相对生物利用度为（97.22831.524）%，其生物利用度符合要求。测得AUC024分别为3.3861.057 mghL-1和3.7311.214mghL-1，AUC0分别为3.7921.001mghL-1和4.0601.105 mghL-1；Cmax分别为0.5070.139mgL-1和0.5500.183mgL-1；Tmax分别为1.7750.617h和1.7750.544h。统计学分析表明，参数AUC和Cmax在两种制剂无显著性差异。试验剂AUC024 90%的可信区间为80.9%105.3%，AUC090%的可信区间为84.1%106.2%，均落在参比的80125之间；Cmax90%的可信限分别为84.4%107.8%，落在参比的75%133%，Tmax经非参数法（Wilcoxon符号秩和检验）检验在两种制剂间无显著性差异，说明试验制剂与参比制剂生物等效。关键词: 更昔洛韦;相对生物利用度;生物等效性;HPLC1 材料与方法1.1 试药 受试制剂：更昔洛韦片，规格：0.5g/片，批号：20110801，湖北唯森制药有限公司。生产日期：2011年8月8日。参比制剂：更昔洛韦片（山东罗欣药业股份有限公司），规格：0.5g/片，批号：1009091。生产日期：2010年9月8日。有效期至2012年9月7日。国药准字H201000301.2 仪器：高效液相色谱仪：Waters 2487 紫外检测仪，Waters 1525 泵,Waters 717自动进样器 , Empower色谱工作站色谱柱：柱号：E2218003，填料：Hypersil ODS 5m，批号：11187，柱长：250mm，管径：4.6mm,生产厂家：大连依利特分析仪器有限公司XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）BR16型高速冷冻离心机优普超纯水机十万分之一分析天平：SHIMADZU AUW220D万分之一分析天平：HANCPING FA1004超声波清洗机 Elmasonic P1.3 受试对象 20名健康男性志愿者,年龄为18-24岁,体重指数在1924范围内，无心、肝、肾、代谢异常等病史，无慢性胃肠道疾病，无药物过敏史及过敏性疾患，无吸烟、嗜酒等不良嗜好，试验前两周至试验期间不用任何其它药物，于试验前签署知情同意书，经全面体检，血、尿常规，肝、肾功能，X线胸片，血压及心电图均无异常发现，临床试验方案获华中科技大学同济医学院伦理委员会批准。1.4 分组与给药 本研究为单剂量给药试验,用两制剂双周期自身对照交叉试验设计。20名受试者按照随机原则分成两组,每组10人,一组先服受试制剂,后服参比制剂;另一组先服参比制剂,后服受试制剂。清洗期为7d。受试者于试验前1d晚餐后,开始禁食不禁水;于试验日晨,空腹po受试制剂或参比制剂1g,温开水200ml吞服,服药2h后,可自由饮水;4h后,进统一清淡低脂饮食。服药期间禁烟、酒和含咖啡因类饮料,避免剧烈运动和长时间卧床。试验前两周至试验期间不服用任何其他药物。1.5 血样采集 受试者于服药前(0h)和服药后的0. 25、0. 5、0. 75、1、1. 5、2、2. 5、3、4、6、8、12、24h由肘静脉采血4mL。血样置于肝素化试管中，离心分离血浆，-80冷冻贮存待测。采用HPLC法测定血药浓度。1.6 血药浓度测定与方法学评价1.6.1 色谱条件：色谱柱：Hypersil C18柱（2504.6mmID，5m）；流动相：甲醇-0.025M磷酸二氢钠pH4.5 (0.05：1.05)；流速：1.1mL/min；柱温：35；检测波长：252nm1.6.2 样品处理精密量取0.5mL血浆至试管中，加入内标液（10.12mg/L喷昔洛韦溶液）40uL，甲醇20L，35%高氯酸20L,二氯甲烷400L, 快速混旋1min,离心10min (12000r/min)。取上清液50uL进样检测。1.6.3 标准曲线制备 更昔洛韦标准溶液的制备：精密称取更昔洛韦4.90mg，置于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，配成浓度为49.0mg/L的更昔洛韦储备液。内标喷昔洛韦溶液的制备：精密称取喷昔洛韦5.06mg，置于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，配成浓度为50.6mg/L的储备液，取20.0 mL储备液，置于100 mL容量瓶中,用超纯水定容，得10.12mg/L的内标溶液。上述各储备液均用经过校正的容量瓶配制，并于4冰箱内保存备用。取更昔洛韦储备液适量，用空白血浆配制成相当于更昔洛韦血浆浓度为0.025，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.6 mgL-1的样品，并分别加入内标溶液（ 喷昔洛韦，浓度10.12mgL-1）40L，按“血浆样品处理”项下操作，进样50L，记录色谱图，以更昔洛韦血浆浓度为横坐标，更昔洛韦与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权二乘法作线性回归运算（w=1/C2），绘制标准曲线,求得第一条标准曲线方程为y=1.41C-0.0174(r0.9995),第二条标准曲线方程为y=1.5C-0.00728（r=0.9983）,第三条标准曲线方程为y=1.43C-0.0111(r=0.9994)。血浆中更昔洛韦浓度在0.0251.60mgL-1范围内线性关系良好。见图1A，1B，1C。1A 标准曲线11B 标准曲线2 1C标准曲线31.6.4 提取回收率 绝对回收率试验 取空白血浆，按“标准曲线”项下操作，制备低、中、高浓度(更昔洛韦0.05，0.2，0.8 mgL-1)的血浆样品，每一浓度进行5样本分析。以提取后待测物色谱峰面积与相同浓度未经提取直接进样获得的色谱峰面积之比，计算更昔洛韦和内标的提取回收率，更昔洛韦低、中、高浓度三种浓度的绝对回收率分别为64.31%、73.63 %、76.42%，数据见表1A。喷昔洛韦（内标）的绝对回收率为56.84%，数据见表1B。表1A HPLC法测定血浆中更昔洛韦的绝对回收率（方法确证）浓度(mg/L)平均回收率（%）SDRSD（%）0.0564.3061.645152.5580.2073.6332.1462.9140.8076.4213.2154.206表1B HPLC法测定血浆中喷昔洛韦（内标）的绝对回收率（方法确证）回收率（%）SDRSD（%）56.8381.9083.3581.6.5 方法回收率与精密度 相对回收率试验 取空白血浆，分别置于离心管中，按“标准曲线”项下操作，制备低、中、高浓度(更昔洛韦0.05，0.2，0.8 mgL-1)的血浆样品，每一浓度进行5样本分析。测定更昔洛韦及内标的峰面积，计算其峰面积比值，并按回归方程求出对应浓度，以此计算相对回收率。低、中、高三种浓度的平均相对回收率为97.14 %、 103.77 %、97.24%。结果见表2。表2A HPLC法测定血浆中更昔洛韦相对回收率（方法确证）浓度(mg/L)回收率（%）SDRSD（%）0.0597.1431.6331.6810.20103.7761.1451.1040.8097.2453.1073.195精密度实验 取空白血浆，按“标准曲线”项下操作，配制低、中、高浓度(更昔洛韦血浆浓度分别为0.05, 0.2, 0.8 mgL-1)的质量控制（QC）样品，每一浓度进行5样本分析，连续测定三天，样本数15，根据标准曲线，计算QC样品的测得浓度，求得批内和批间精密度的相对标准差(RSD)均小于8%，结果见表5B,5C。表2B HPLC法测定血浆中更昔洛韦的日内精密度浓度（mg/L）日内精密度（mg/L）SDRSD（%）0.050.05480.002564.6740.200.1970.005642.8580.800.8010.02613.259表2C更昔洛韦血药浓度检测日间精密度考察（方法确证）参数血药浓度(mg/L)0.50.200.80均值(mg/L)0.05270.2090.811标准差0.002810.002860.0196日间相对标准差(%)5.3381.3702.4221.6.6 样品稳定性考察 1） 本试验考察了处理后的更昔洛韦血浆样品室温放置24h的稳定性、未经处理的更昔洛韦血浆样品室温放置2h的稳定性、血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性以及血浆样品-60冷冻放置30天的稳定性。取空白血浆，按“标准曲线”项下操作，配制更昔洛韦低、中、高浓度的血浆样品，每一种浓度水平每一条件的稳定性考察进行5样本分析，用HPLC法测定,结果见表3A，表3B，表3C和表3D。还考察了冷藏条件下更昔洛韦储备液50天稳定性和室温放置6h稳定性，结果见表3E，表3F。表3A 处理后的更昔洛韦血浆样品在室温放置24小时的稳定性（方法确证）浓度(mg/L)0.050.20.8平均值0.05260.2030.802SD0.00120.00520.0308RSD(%)2.2812.5563.835表3B 更昔洛韦血浆样品在室温放置2小时的稳定性（方法确证）浓度(mg/L)0.050.20.8平均值0.05340.2230.8502SD0.001360.001020.0212RSD(%)2.5400.4582.496表3C 更昔洛韦血浆样品经历3次冷冻解冻-循环的稳定性（方法确证） 冻融一次浓度(mg/L)0.050.20.8平均值(mg/L)0.0480.1970.738SD0.00370.00350.024RSD(%)7.6831.7583.219冻融二次平均值(mg/L)0.04620.1990.766SD0.0007480.002320.0155RSD（%）1.6191.1622.030冻融三次浓度(mg/L)0.050.20.8平均值(mg/L)0.05380.1980.784SD0.001720.007440.0198RSD(%)3.1983.7532.532表3D 更昔洛韦血浆样品在-80冷冻放置30天的稳定性（方法确证）浓度(mg/L)0.050.200.80平均值0.05620.2110.855SD0.001330.007350.0308RSD(%)2.3603.4833.603表3E 冷藏条件下更昔洛韦储备液50天稳定性（测定浓度0.8mg/L）（方法确证）时间50天前50天后更昔洛韦面积平均值117756.4122159.8SD171.915911.143RSD(%)0.1460.746表3F 更昔洛韦水溶液（浓度0.05mg/L）室温放置6h稳定性数据（方法确证）时间6h前6h后更昔洛韦面积平均值76137264SD41.80459.953RSD(%)0.5490.8251.6.7 方法专属性 分别取空白血浆0.5mL，按“血浆样品处理”（不加内标溶液）项下操作，进样50uL，得6个空白血浆色谱图(图2A1,图2A2,图2A3,图2A4,图2A5,图2A6)；将一定浓度的标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，同法操作得血浆样品色谱图(图2B)；取受试者口服给药后的血浆样品，同法操作得供试者血浆样品色谱图(图2C)。结果表明，血浆中的内源性物质不干扰测定。图2A1 空白血浆图谱（编号：90001 11 109168 O Z0013V00 Rh(+)）图2A2 空白血浆图谱（编号：90001 11 087210 A Z0014V00 Rh(+)） 图2A3 空白血浆图谱（编号：90001 11 145854 O Z0013V00 Rh(+)）图2A4 空白血浆图谱（编号：90001 11 070034 B Z0013V00 Rh(+)） 图2A5 空白血浆图谱（编号：90001 11 133889 B Z0013V00 Rh(+)）图2A6 空白血浆图谱（编号：90001 11 001026 AB Z0013V00 Rh(+)）图B 空白血浆药物内标色谱图图C 受试者给药后1.5小时色谱图1.7 数据处理 1.71药动学参数计算采用非房室模型依耐性参数估算方法，用药理学计算软件（DAS2.0）处理血药浓度数据并计算参数。AUC0t用梯形法计算；AUC0按下式计算：AUC0AUC0t+Ct/ke，t1/2ke用药时曲线末端相计算（t1/2ke=0.693/ke），Cmax和Tmax用实测值。1.72生物利用度的估算方法相对生物利用度（F）按公式：F=（ AUCT / AUCR）100%。1.73 统计学分析及生物等效性评价AUC和Cmax经对数转换后进行方差分析，并进一步采用双单侧t检验和（1-2a）置信区间法进行生物等效性评价。Tmax采用非参数法检验（秩和检验）进行统计。若受试制剂AUC的90%置信区间在参比制剂相应参数的80.0%-125.0%范围内，且受试制剂Cmax的90%置信区间在参比制剂相应参数的75%-133%范围内，即可判断两制剂生物等效。2 结果2.1血药浓度20名健康志愿者随机交叉单剂量口服更昔洛韦片试验制剂和参比制剂各1000mg，用HPLC法测得的血药浓度-时间数据见表4A表4B。各受试者及其平均血药浓度-时间曲线见图3。表4A 健康志愿者单剂量口服1000mg更昔洛韦片（参比制剂）血药浓度时间00.250.50.7511.522.534681224X00.1040.2090.2980.3670.4580.4950.4780.4420.3510.2260.1580.0900.042SD00.0960.1160.1570.1770.1650.1730.1700.1650.1410.0840.0590.0320.010RSD(%)92.455.452.648.236.034.935.637.340.037.337.435.624.5（注：18和21号脱落）表4B志愿者单剂量口服1000mg更昔洛韦片（试验制剂）血药浓度时间00.250.50.7511.522.534681224X00.0850.2150.2940.3880.4610.4510.4360.3960.3090.1990.1400.0800.043SD00.1030.1690.1450.1690.1460.1410.1310.1340.1080.0610.0430.0310.014RSD(%)120.878.449.543.631.631.230.033.735.130.930.638.432.2（注：18和21号脱落）图3 20名健康受试者平均血药浓度-时间曲线图因本次试验中，18，21号受试者在试验中未能按要求进食，剔除。2.2药代动力学参数计算各主要药代动力学参数AUC024、AUC0、t1/2ke，以及实测值Cmax、Tmax见表5表7。表5健康志愿者单次剂量口服1000mg更昔洛韦片试验制剂和对照制剂药代动力学参数 参数组别试验药对照药Tmax(h)1.7750.6171.7750.544Cmax（mgL-1）0.5070.1390.5500.183T1/2(h)5.2932.0715.9942.543AUC0t（mghL-1）3.3861.0573.7311.214AUC0（mghL-1）3.7921.0014.0601.105表6 志愿者单次剂量口服1000mg更昔洛韦片（对照药）药代动力学参数 统计参数T1/2(h)Cmax(g/mL)Tmax(h)AUC(0-t)(g/mL*h)AUC(0-)(g/mL*h)AUC(0-t)/AUC(0-)MRT(h)Mean5.9940.5501.7753.7314.0600.9136.678SD2.5430.1830.5441.2141.1050.1261.268RSD(%)42.433.230.632.527.213.919.0（注：18和21号脱落）表7 健康志愿者单次剂量口服1000mg更昔洛韦片（试验药）药代动力学参数统计参数T1/2(h)Cmax(g/mL)Tmax(h)AUC(0-t)(g/mL*h)AUC(0-)(g/mL*h)AUC(0-t)/AUC(0-)MRT(h)Mean5.2930.5071.7753.3863.7920.9006.500SD2.0710.1390.6171.0571.0010.1641.401RSD(%)39.127.