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DNA受重离子辐射后的结构变化和碎片长度分布 赵葵隋丽倪嵋楠郭继宇梅俊平孔福全路秀琴周平原子能院核物理所 第十次全国核结构讨论会 脱氧核糖核酸 DNA 腺嘌呤 腺嘧啶 鸟嘌呤 胞嘧啶 脱氧核糖核酸 DNA 在辐射生物学和放射医学中 DNA是电离辐射引致细胞杀伤或转化的主要靶分子 DNA的辐射损伤是辐射所致生物效应中最基本和最关键的一环 电离辐射致DNA的损伤 电离辐射损伤DNA途径 直接作用指射线直接作用于DNA分子 通过电离和激发使DNA受到损伤 间接作用指射线与DNA周围其它原子或分子特别是水分子作用 产生具有很高活性的自由基 如 OH H和eaq 进而损伤DNA 碱基变化脱氧核糖变化DNA链断裂 单链断裂 SSB 双链断裂 DSB 交联 DNA链交联DNA 蛋白质交联其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初损伤 而非重接性的DSB则被认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤 电离辐射致DNA分子的变化 DNA链断裂示意图 单链断裂 双链断裂 单链断裂 是DNA双螺旋结构中一条链断裂 双链断裂 是DNA的两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂 是具有高传能线密度 LET 的电离辐射 它所引起的能量沉积密集 局部剂量大 与低LET辐射 如X 射线和电子束等 相比 通过物质时有完全不同结构的电离径迹 所引起的损伤机制也极为复杂 重离子的特征 质子和碳离子在水中径迹比较 国内外的研究DSB的方法 中性梯度沉降中性过滤淘析凝胶电泳早期染色体凝缩电子显微镜原子力显微镜 这几种方法都有一定的适用范围和局限性 不同程度地存在着灵敏性差 物理基础不清楚及操作复杂等缺点 近来的一些研究证实 这些方法低估了DSBs的产额 原子力显微镜 AFM 原理 具有可达几纳米的高分辨本领 可以研究包括绝缘体和导体在内的许多不同材料的表面原子结构和组织形态 还可以用于有机分子和生物样品的研究 因而有更加广泛的应用领域 原子力显微镜 AFM 特点 利用AFM研究DSB状况 利用AFM观测电离辐射致DNA双链断裂在国外 从1996年起 仅有的几个实验研究中 所用的电离辐射源是电子 X射线 射线和 粒子 给出了辐照后DNA分子的结构变化 利用AFM研究DSB状况 1 1996年美国乔治华盛顿大学的D PANG等人用AFM在水溶液中测量辐射 电子 引起的DNA双链断裂的第一个实验 D Pangetal Scan Microsc 10 1996 1105 1110 B 50Gy 750 850nm占88 平均长度790nm C 100Gy 750 850nm占67 143 750nm占23 平均长度690nm D 150Gy 最多碎片200nm长 占40 平均长度400nm E 200Gy 50 150nm占36 150 250nm占32 平均长度200nm 利用AFM研究DSB状况 2 1998年D Pang等人又用同样方法测量了中子引起的DNA损伤 D Pangetal RadiationResearch150 1998 612 618 中子对DNA的辐射 导致了许多短碎片的产生 DSBs的分布更局部 更密集 为成团的DNA双链断裂提供了实验证据 3 2000年 日本辐射生物科学研究所的一个小组用AFM研究了60Co的 射线诱发的DNA损伤 观测到了闭环 完整DNA分子 开环 单链断裂 和线性 双链断裂 三种形态的质粒DNA及它们随剂量的变化情况 利用AFM研究DSB状况 利用AFM研究DSB状况 利用AFM直接观测重离子诱发的DNA链断裂的实验则未见正式报道 我们采用加速器辐照技术与先进的原子力显微镜技术相结合的研究方法 以生物大分子DNA为切入点 在分子水平上研究重离子诱发的DNA双链断裂 HI 13串列加速器平面图 HI 13串列加速器可加速的重离子及其在生物 水 中的特性 实验设施的其它优势 重离子扫描辐照装置 可以在3 30cm范围内提供均匀的束流 北京Q3D磁谱仪可提供均匀的 无 辐射 低本底辐射源 串列加速器已经加速了碳的微集团束 微束装置 原子力显微镜 重离子扫描装置 北京Q3D磁谱仪 Q3D磁谱仪结构示意图 AJ 型扫描探针显微镜 AJ 型扫描探针显微镜的技术指标 样品台大小 10mm扫描范围6 6 m max 分辨率STM x y 0 1nm z 0 01nmAFM x y 1 0nm z 0 1nm电子学为DSP控制 实验研究进展 1 利用HI 13串列加速器产生的的7Li和12C重离子 以不同的剂量 1 2 4 6 8 10Gy 对纯化的pGEM T1质粒DNA水溶液进行了辐照 2 利用原子力显微镜对辐照后的DNA进行了观测 给出DNA形态随剂量的变化 3 得到不同剂量下DNA碎片长度的分布函数 并用Tsallis熵统计理论对实验结果进行了拟合 重离子辐射致DNA链断裂碎片的AFM观测 辐照用重离子种类及相应物理参数 辐照用DNA样品pGEMT 1质粒DNA 水溶液 形态为超螺旋和开环 注 LET值为在水中的LET值 未辐照pGEMT 1质粒DNA 7Li离子辐射致DNA断裂碎片的AFM观测 AJ 型AFM A 辐照剂量为1 0Gy B 辐照剂量为6 2Gy 7Li离子辐射致DNA断裂碎片的AFM观测 AJ 型AFM A 剂量为4 1Gy B 剂量略大于10Gy 7Li离子辐照后DNA分子三种形态所占比例与剂量的关系 SC 超螺旋OC 开环L 线性 7Li离子辐射致DNA断裂碎片长度的分布 A 剂量为2 1Gy B 剂量为4 1Gy C 剂量为6 2Gy D 剂量为8 2Gy E 剂量l略大于10Gy 12C离子辐射致DNA断裂碎片的AFM观测 A 辐照剂量为1 1Gy B 辐照剂量为8 1Gy 12C和7Li离子辐射致DNA断裂碎片长度分布的比较 8 1Gy的12C离子 8 2Gy的7Li离子 DNA双链断裂的统计模型分析 借用Tsallis熵拟合实验数据 其中 为拉格朗日乘子 q为实数 由于DNA的双链断裂在空间上是有关联的 因此 用Tsallis熵来研究这种带有关联的DNA双链断裂 利用Tsallis熵宏观统计理论推导出的DNA双链断裂的分布函数如下 Tsallis熵拟合 8 2Gy的7Li离子 8 1Gy的12C离子 实验数据 拟合曲线 实验数据 拟合曲线 AFM显微技术 是在分子水平上研究辐射所致DNA损伤的有力工具 与传统的分子生物学技术相比 AFM能够区分DNA分子的各种形态 并能实现对重离子辐照诱发的DNA较小片段的测量 结论一 在同一LET值下 随着剂量的增加 DNA分子的形态由SC型逐渐向OC型或L型变化 且碎片的长度逐渐缩短 在相同辐照剂量下 随LET值的增加 诱发的DNA较短碎片的数目越来越多 高LET的重离子辐射与低LET辐射相比 能够更有效的诱发DNA分子发生双链断裂 并使双链断裂的分布更局部和更密集 使用Tsallis熵宏观统计理论 对DNA碎片长度分布的实验数据的拟合结果说明重离子诱发的DNA双链断裂在空间上有较强的关联 结论二 展望 DNA损伤