转基因植物的鉴定.ppt

转基因植物的鉴定 进行基因转化后 外源基因是否进入植物细胞 进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上 整合的方式如何 整合到染色体上的外源基因是否表达 这一系列的问题仍需回答 只有获得充分的证据后才可认定被检测的材料是转基因的 目前认为转基因植物的证据应有以下几点 要有严格的对照 包括阳性及阴性对照 转化当代要提供外源基因整合和表达的分子生物学证据 物理数据 southern杂交 northern杂交 western杂交 与表型数据 酶活性分析或其它 提供外源基因控制的表型性状证据 如抗虫 抗病等 根据该植物的繁殖方式 有性繁殖还是无性繁殖 提供遗传证据 有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的证据 无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据 外源基因整合的鉴定证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是DNASouthern分子杂交 只有经过分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物 核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列 或某一区段互补 的两条多核苷酸链 通过碱基配对形成稳定的双链分子的过程 若其中的一条链被人为标记上 该标记可以通过某种特定方法检出 即成为所谓的探针 探针与其互补的核苷酸序列杂交后 杂交体也就带上了同样标记 可被检测出来 这样 以特定的已知核苷酸序列做探针 就可以在诸多的核苷酸序列中 通过杂交探测出与其互补的序列 因而分子杂交是进行核酸序列分析 重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段 它具有灵敏性高 可检出10 12g 即1pgDNA样品 特异性强 可鉴别出20个碱基对左右的同源序列 的特点 是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法 根据杂交时所用的方法 核酸分子杂交又可分为印迹杂交 斑点 dot 杂交 狭槽 slot 杂交和细胞原位 insitu 杂交等 鉴定转基因植株所涉及到的核酸分子杂交有Southern杂交及Northern杂交 Southern杂交是以DNA或RNA为探针 检测DNA链 不仅可鉴定外源基因的整合 还可初步鉴定插入的拷贝数 PCR是聚合酶链式反应 polymerasechainreaction 的简称 它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用 根据检测的目的片段及一定的原则设计引物 与模板DNA经过变性 退火 延伸三步骤的数个循环 对特异DNA序列进行扩增 可以在一只小小的离心管中几小时内使目的DNA片段扩增数百万倍 PCR检测所需的模板量仅为10ng以内 而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增效果 因而这一技术的出现为外源基因整合的检测提供了便利条件 尤其是在转化材料少又需及早检测的时候 但由于PCR扩增十分灵敏 有时会出现假阳性扩增 因此检测的只是初步结果 外源基因转录水平的鉴定 基因表达分为转录及翻译两阶段 转录是以DNA 基因 为模板生成mRNA的过程 翻译是以mRNA为模板生成蛋白质的过程 检测外源基因的表达就是检测特异mRNA及特异蛋白质的生成 所以基因表达检测分为两个水平 即转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测 转录水平上的检测主要方法是Northern杂交 它是以DNA或RNA为探针 检测RNA链 和Southern杂交相同 Northern杂交包括斑点杂交和印迹杂交 也可用RT PCR reversetranscribedPCR 方法检测外源DNA在植物体内的转录表达 其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录 然后再经PCR扩增 如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增条带 则表明外源基因实现了转录 此法简单 快速 但对外源基因转录的最后决定 还需与Northern杂交的实验结果结合 外源基因表达蛋白的检测 表达蛋白的检测方法有三种 生化反应检测法 主要通过酶反应来检测 免疫学检测法 通过目的蛋白 抗原 与其抗体的特异性结合进行检测 具体方法有Western杂交 酶联免疫吸附法 ELISA 及免疫沉淀法 生物学活性的检测 Western杂交是将聚丙烯酰胺凝胶 SDS PAGE 电泳分离抗原 Antigen 固定在固体支持物上 如硝酸纤维素膜 NC膜 不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移率不同 据此可确定特定的抗原存在与否以及相对丰度 或者蛋白质是否遭到降解等 蛋白质电泳后转到NC膜 放在蛋白质 如牛血清蛋白BSA 或奶粉溶液中 温育 以封闭非特异性位点 然后用含有放射性标记或酶标记的特定抗体杂交 抗原 抗体结合 再通过放射性自显影或显色观察 ELISA与经典的同位素标记为基础的液 液抗