猪繁殖与呼吸综合征（prrs）病毒基因工程疫苗研究

肖少波华中农业大学动物病毒室 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗研究 猪繁殖与呼吸综合征 PRRS 又称兰耳病1987年首次暴发于美国北卡罗纳州 神秘病 导致至少100万头猪死亡1991年 PRRS席卷欧洲大陆1996年 PRRS在我国首次爆发 同年 丹麦再次暴发PRRS 全国40 50 的母猪出现流产 死胎和断奶前仔猪的大量死亡2000年 美国再次大爆发PRRS 并将其列为当前最严重的猪病毒性传染病目前 PRRS遍及世界养猪国 并呈流行态势 猪繁殖与呼吸综合征 猪繁殖与呼吸综合征的危害 母猪 早产 流产 死胎 弱仔公猪 精液品质下降初生仔猪 高死亡率其它年龄猪 呼吸系统疾病 蓝耳病流行新动向 近年来 病原致病力似有所增强 表现为怀孕母猪更加严重的流产和新生仔猪的高死亡率 Oleksiewicz etal 非典型性病原导致的 流产风暴 自1999年Rossow等在蓝耳病高发猪群中分离到嗜神经型蓝耳病病毒以来 目前越来越多的嗜神经型蓝耳病病毒被分离 提示蓝耳病病毒可能在扩大其靶组织或器官 蓝耳病流行新动向 最近 欧洲型PRRSV在北美洲被多次分离到 表明该病的流行已不再局限于原来欧洲型只出现在欧洲的格局 预示欧洲型PRRSV可能正在向世界范围蔓延 蓝耳病流行新动向 PRRSV导致的直接经济损失越来越大根据美国农业部2005年统计的资料表明 2004年 蓝耳病导致的直接经济损失为5 6032亿美圆 Neumannetal JAmVetMedAssoc 2005Aug1 227 3 385 92 蓝耳病流行新动向 蓝耳病导致的间接危害越来越严重 蓝耳病病毒容易与伪狂犬病毒 猪胸膜肺炎放线杆菌 猪圆环病毒 猪流感病毒 猪细小病毒 猪呼吸道冠状病毒 PRCV 混合感染 严重干扰猪瘟的免疫效果 免疫抑制 最近 还从所谓 无名高热 病料中分离到PRRSV 能保护猪不出现临床症状 但不能阻止强毒感染 只适合3 18周龄的猪和非孕母猪使用 存在散毒问题和返强性 并且返强的几率相当高 可达30 PRRS免疫预防现状 弱毒苗 丹麦事件的教训 丹麦1996年7月使用美洲型PRRS弱毒疫苗免疫后 1996年底至1997年初出现了PRRS的多次大暴发 全国40 50 的母猪出现流产 死胎和断奶前仔猪的大量死亡 病毒分离与全基因组序列分析证实是由疫苗株引起的 Masdenetal 1998 Botneretal 2000 与疫苗株同源性高达98 以上的强毒株越来越多目前 许多国家已禁止使用弱毒苗 PRRS免疫预防现状 弱毒苗 较弱毒苗安全 但产生的保护力不强 需要反复多次的免疫接种 而且效果不稳定 还经常导致免疫失败 疫苗安全性与有效性的矛盾以及目前尚无更好的疫苗使PRRS的免疫预防处于一种两难境况 迫切需要更安全 高效 廉价的新型疫苗 PRRS免疫预防现状 灭活苗 蓝耳病病毒结构 亚单位疫苗DNA疫苗腺病毒载体疫苗伪狂犬病毒载体疫苗 新型疫苗研究现状 主要集中在具有诱导机体产生最强中和抗体能力的GP5蛋白 但所有以GP5为目的抗原的新型疫苗免疫猪后均未检测到PRRSV的中和抗体 不能完全阻止蓝耳病及病毒血症的发生 GP5基因的修饰 在GP5基因N端的覆盖表位与中和表位间插入辅助序列 使中和表位充分展示5 FAVLVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELN 3 表位A 覆盖表位 表位B 中和表位 辅助序列 表达修饰的ORF5m基因的DNA疫苗 免疫小鼠 检测ELISA抗体 中和抗体和细胞免疫 ELISA抗体 小鼠 以修饰的ORF5m基因构建的pCI 52M诱发特异性针对GP5蛋白的ELISA抗体显著高于未经修饰的pCI 52 中和抗体 小鼠 以修饰的ORF5m基因构建的pCI 52M于首免小鼠后2周即产生可检测中和抗体 1 4 并且诱发的中和抗体水平显著高于未经修饰的pCI 52 最高达到1 32 细胞免疫 小鼠 以灭活的PRRSV病毒为特异性刺激原 修饰的ORF5m基因构建的pCI 52M诱发细胞免疫水平显著高于未经修饰的pCI52 修饰型ORF5m基因具有更强的免疫原性 有希望成为新一代疫苗候选基因 研究表明 Fangetal VirusGenes 2006 32 5 11 ORF5与ORF6基因共表达DNA疫苗 kDa 75 0 50 0 M 19kDa GP5 25kDa M M 35kDa GP5 M 42kDa 37 0 25 0 20 0 15 0 1234 1234 50mMDTT AB Westernblot检测变性条件 A 和非变形条件 B 体外共表达的GP5和M蛋白形成异源二聚体 1 pCI ORF5 ORF6 2 pCI ORF6 3 pCI ORF54 pCI neo ORF5 ORF6双基因共表达对GP5和M蛋白的亚细胞定位的影响 CMV P ORF6 pCI 6RFP polyA P CMV ORF5 polyA P CMV ORF6 pCI 5GFP6RFP ORF5 polyA pCI 5m4EGFP P CMV m4EGFP polyA RFP m4EGFP RFP RFP GP5 mut4EGFP M DsRed2 A pCI 5GFP B pCI 6RFP C pCI 5GFP 6RFP D pCI 5GFP 6RFP GP5蛋白单独表达时主要定位在细胞核周围的内质网 而与M蛋白共表达形成异源二聚体时定位模式发生改变 主要定位在高尔基体 ORF5 ORF6双基因共表达显著增强中和抗体 GP5和M蛋白共表达较单独表达所产生的中和抗体显著增强 最高达1 32 GP5和M蛋白共表达较单独表达所产生的细胞免疫应答显著增强 同时联合免疫也表现出一定程度的提高 ORF5 ORF6双基因共表达显著增强细胞免疫 研究表明 1 体外表达的GP5蛋白可以与M蛋白通过二硫健形成异源二聚体 并且这种二聚体的形成有利于GP5蛋白从内质网向高尔基体的转运 有利于免疫提呈的增强 提高免疫应答 2 GP5 M异源二聚体形成的几率和多少与免疫反应的强弱具有正相关性 GP5和M蛋白共表达为新型疫苗的研究提供了新的思路 Jiangetal 2006 Vaccine 24 15 2869 2879 ORF5m与ORF6基因共表达DNA疫苗 polyA P CMV ORF5m polyA P CMV ORF6 pCI ORF5m ORF6 ORF5m与ORF6基因共表达增强中和抗体 ORF5m与ORF6基因共表达增强细胞免疫 PRRSV新一代疫苗设计 具有更好免疫原性的ORF5m基因为候选基因 采取GP5m和M蛋白共表达策略 以PRV基因缺失标志疫苗株表达系统 构建PRV PRRSV二价基因工程疫苗 PRV PRRSV重组病毒构建流程图 RV5 TK gE GP5 RV56 TK gE GP5 M RV5m TK gE GP5m RV5m6 TK gE GP5m M 构建的rPRV PRRSV重组病毒 重组病毒免疫小鼠后的PRV中和抗体 重组病毒免疫小鼠对PRV的免疫保护 重组病毒免疫小鼠后的PRRSV中和抗体 GP5与M双基因共表达能有效提高针对PRRSV的中和抗体水平以修饰的GP5m基因构建的重组病毒能显著提高PRRSV中和抗体水平 其中以TK gE GP5m M 最为明显 重组病毒免疫小鼠后均能产生特异性的淋巴细胞增殖反应 以修饰的GP5m基因构建的重组病毒均能显著提高特异性细胞免疫反应 其中以TK gE GP5m M 最为明显 TK gE 重组病毒免疫小鼠后的PRRSV细胞免疫 重组疫苗对猪的免疫反应与攻毒保护 重组疫苗rPRV5m6PRRSV灭活疫苗阴性对照PRVTK gE gI 重组疫苗产生的针对PRV的抗体 PRRSV中和抗体检测 针对PRRSV的细胞免疫反应 RV5m6免疫组PBMC中特异性针对PRRSV的淋巴细胞增殖显著高于灭活苗对照组 尤其在攻毒后RV5m6免疫组增殖水平迅速上升 表现出记忆T细胞免疫反应 攻毒后体温变化 阴性对照于攻毒后体温出现明显的发热 40 并且波动较大 KV免疫组出现一过性的发热 但RV5m6一直未出现发热 攻毒后的病毒血症和排毒 肺部组织病理变化 Negcontrol PRRSV灭活苗 重组疫苗 健康猪 肺门淋巴结病理变化 Negcontrol PRRSV灭活苗 重组疫苗 健康猪 攻毒后病毒分布情况 研究表明 以伪狂犬病毒为载体共表达修饰的GP5m和M蛋白的重组疫苗能够同时诱发较强的针对PRV和PRRSV的免疫应答 具有较好的免疫保护 有望成为新一代安全 高效的PRRSV新型疫苗 临床初步应用 免疫预防对发病猪的紧急接种 进一步对ORF5基因进行修饰 目前已获得18个突变体 其中对ORF5进行糖基化修饰后的突变体ORF5 34 51 较天然的GP5产生的中和抗体高100倍 构建伪狂犬病 蓝耳病 圆环病毒 猪瘟的四价基因工程疫苗 正在开展的研究 自杀性 DNA疫苗 以甲病毒复制子为载体 自主复制 保障外源基因的高效表达 诱导被转染细胞发生细胞凋亡 增强免疫提呈 避免常规DNA疫苗整合到宿主基因组 细胞转化等潜在的安全性隐患 是一种更安全 更有效的新型核酸疫苗 PRRSV 自杀性 DNA疫苗 中国授权发明专利 ZL200410000238 0 DNA疫苗 18种 pCI 52pCI 5mpCI ORF6pCI 56pCI 5m6 pCI 52 IL2pCI 53pCI VP22 5mpCI VP22 5m6 自杀性DNA疫苗 4种 pSFV 52pSFV 5mpSFV 56pSFV 5m6 自杀性DNA疫苗免疫猪后诱导的中和抗体 免疫猪后诱导的细胞免疫 pSFV 5m6 RV5m6免疫猪后PRRSV中和抗体 pSFV 5m6和RV5m6免疫组于首免后42d即可检测到中和抗体 1 4 并趋于上升 攻毒后pSFV 5m6和RV5m6免疫组中和抗体水平快速上升 显著高于灭活苗对照组 PBMC的淋巴细胞增殖 pSFV 5m6和RV5m6