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高效液相色谱 highperformanceliquidchromatography HPLC 中南大学湘雅医学院医学检验系徐克前 一基本原理 一 定义 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同 进行连续的 无数次的交换和分配而达到分离的过程 组成 固定相 柱内填料流动相 洗脱剂 二 固定相 stationaryphase 和流动相 mobilephase 1 化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶表面OHOH 硅胶 SiO2 nH2O Si O Si 键合相反应 R1 Si OH X Si R Si O Si R HX R2硅胶有机硅烷键合相X Cl CH3O C2H5O等R 烷C8 C8H17 C10 C10H21 C18 C18H37 等R1R2 Z CH3等 2 十八烷基硅烷键合硅胶填充料 octadecylsilyl ODS 万能柱即C18柱或ODS柱主要用于反相HPLC中 适用于各种类型的生物分子 3 短链烷基键合物短链烷基 c3 c4等 大孔硅胶键合物适用于氨基酸 小肽等生物小分子 4 键合到基质上的官能团性质 反相柱 填料是非极性的 官能团为烷烃 如C18 C8 C4等正相柱 填料是极性的 官能团为 CN NH2等离子交换键合相 阳离子官能团 SO3H COOH等 阴离子官能团 NH2 R4N 等 2 流动相 mobilephase 流动相选择原则 1 样品易污 且溶解度尽可能大2 化学性质稳定 不损坏柱3 不妨碍检测器检测分析4 粘度低 流动性好5 易于从中回收样品6 无毒或低毒 易于操作7 易于制成高纯度 即色谱纯8 废液易处理 不污染环境 反相色谱常用流动相及冲洗强度H2O 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 异丙醇 四氢呋喃最常用组成 甲醇 H2O 乙腈 H2O洗脱顺序 极性物先洗脱下来正相色谱常用流动相及冲洗强度正乙烷 乙醚 乙酸乙酯 异丙醇 二 分离模式 正相HPLC反相HPLC离子交换HPLC凝胶HPLC亲和HPLC 一 正相HPLC normalphaseHPLC NP HPLC 固定相 极性吸附剂 或极性键合相 如硅胶 Al3O2流动相 非极性或弱极性溶剂 如己烷 庚烷等洗脱顺序 非极性 弱极性 极性应用 石油化工产品 染料 农药 医药 有机酸 有机碱等 二 反相HPLC reversephaseHPLC RP HPLC 固定相 非极性物质 如C18 ODS C10 C8 C6 C4 C2流动相 极性溶剂 如甲醇 H2O 乙腈 H2O等洗脱顺序 极性 弱极性 非极性应用 蛋白质 多肽等 三 离子交换HPLC ion exchangeHPLC IE HPLC 原理 用离子交换剂作固定相 根据不同组分在一定pH下 组分电荷性质和数量不同而分离的技术分类 阳离子交换树脂 含酸性基团 阴离子交换树脂 磺酸基 磷酸基等 合碱性基团 季胺基 叔胺基等 应用 核酸 蛋白质 氨基酸等 四 凝胶HPLC gelHPLC G HPLC 原理 基于分子大小和形状的差异进行分析的技术固定相 交联葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶流动相 水 乙醇 丙酮等应用 核酸 蛋白质 酶 多糖等 五 亲和HPLC affinityHPLC AF HPLC 原理 利用生物大分子间专一的亲和力进行分离的技术固定相 基质 琼脂糖凝胶等 交联配基 亲和性 应用 酶 抗体 抗原 受体等 三 HPLC仪器HPLC仪一般由输液系统 进样系统 色谱柱 检测器 记录和数据处理系统及计算机等几部分组成 一 输液系统 贮液及脱气装置梯度洗脱装置高压输液泵 梯度洗脱装置 高压输液泵 二 进样系统 三 柱系统 四 检测器 与泵 柱组成HPLC的三大关键部件 1 紫外吸收检测器 2 荧光检测器 4 示差折光检测器 表 HLPC常用检测器检测器原理检测下限 g ml 检测范围紫外检测器具有紫外吸收性质10 7荧光检测器具有荧光物质10 14电化学检测器具有电解活性物质10 12示差折光检测器与流动相折光率不同10 7糖类等 蛋白质 核酸 氨基酸 多肽 激素等 多环芳烃 氨基酸 维生素等食品 环境 生化 医学等 五 不同HPLC产品介绍 高效液相色谱仪器 高效液相色谱仪器 2 高效液相色谱仪器 3 高效液相色谱仪器 4 四 定性和定量 定性分析 保留值定性 比较未知峰与标准物的保留值 收集未知峰洗脱液定性 物理分析 化学分析 生物学分析 联机定性 液质联用 液红联用 定量分析 分析检测物质的量 或浓度 与检测器的响应值 峰面积或峰高 呈正比1 标准曲线法 也称外标法或直接比较法 用标准品等体积直接进样 得标准曲线 再用待测样品的峰面积 或峰高 与其对