液相色谱原理与方法.ppt

1 液相色谱原理与方法 分离原理检测原理HPLC技巧HPLC检定和认证方法开发与验证 2 液相色谱分离原理 液固 吸附 色谱液液 分配 色谱键合相色谱正相色谱反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱空间排阻色谱亲和色谱 液相色谱分类 3 吸附色谱 分离机理 化合物在固定相表面吸附中心的竞争吸附 是物理吸附 表面吸附 流动相分子和样品分子竞争性吸附在固定相的特定位点上 该吸附是可逆的 吸附色谱固定相极性酸性 硅胶 碱性 氧化镁 硅酸镁分子筛 三氧化二铝等 非极性 活性炭 4 吸附色谱流动相常使用烷烃为底剂 加入适当的极性调整剂 溶剂极性越大 洗脱能力越大 注意 不能使用含水的流动相 因为硅胶遇水会失活 微量水可改善拖尾状况 有时用水作减尾剂 吸附色谱 5 吸附色谱的分离机理 随着样品在固定相上的吸附能力由大到小在色谱柱上的保留由长到短 6 分离物质对中等分子量的油溶性样品可获得最佳分离 例如油品 脂肪 芳烃等对具有不同极性取代基的化合物或异构体有较好的选择性但对于强极性或离子型的化合物会产生不可逆吸附 对同系物分离能力较差优点 样品负载能力大稳定性好 pH 3 8 吸附色谱 7 液液分配色谱 分离原理被分离的组分在流动相和固定相中的溶解度不同进行分离 该过程是一个分配平衡过程 固定相 惰性载体 担体 上机械涂布固定液固定液容易流失 导致保留值减小 柱效下降 化学键合固定相已经逐步取代了液液色谱固定相 8 分配色谱的分离机理 9 1 稳定性正相键合相的稳定性要小于反相键合相反相键合相使用PH为2 7 5 PH 7 5会引起基体硅胶溶解2 重现性同一种类型的键合相 因厂家不同 生产批号不同 会表现不同的分离特性 表现为重复性差3 键合相色谱柱的再生吸附 缔合等作用使柱效降低正相色谱柱再生 1 1甲醇 氯仿反相色谱柱再生 甲醇 丙酮 二甲基甲酰胺 0 01mol L无机酸 硫酸pH 2 键合相色谱 键合相使用的注意点 10 键合相色谱 流动相的选择 正相色谱 反相色谱 水 正相 反相色谱中溶剂选择性示意图 11 键合相色谱 正相色谱 正相液相色谱流动相极性小于固定相极性分离机制 范德华作用力的定向作用力 诱导作用力及氢键作用力 氢键力是主要的作用力 固定相 键合的氨基 NH2 腈基 CN 醚基 O 等氢键力 氨基 腈基 芳硝基 二醇基 醚基流动相 常使用烷烃为底剂 加入适当的极性调整剂 溶剂极性越大 洗脱能力越大 适用范围 不溶于水 有机混合液的亲脂样品 异构体拆分和制备液相 12 氨基柱 极性强 具有碱性 可在酸性水溶液中作弱阴离子交换剂 分离酚 羧酸 核苷酸等类物质 与糖分子中的羟基作用 可分离单糖 二糖 多糖 注意 氨基柱不能分析含有羰基的化合物 如醛 酮 还原糖等 流动相不能用丙酮 键合相色谱 正相色谱 13 腈基柱 中等极性 分离选择性与硅胶类似 但保留值比硅胶低 对酸性 碱性样品可获得对称峰 对含双键的异构体或双键环状化合物有良好的分离能力 芳硝基柱 弱极性对芳香族化合物及多环芳烃有良好的分离选择性 键合相色谱 正相液相色谱 14 二醇基柱 弱极性可分离有机酸及其共聚物 也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相醚基柱 弱极性可分离能形成氢键的化合物 如酚类和硝基化合物也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相 键合相色谱 正相液相色谱 15 HPLC的正相柱 硅胶基底 常用氰基 常用氨基 分析糖二醇基柱 分析蛋白质 硅胶 Si Si Si CH2CH2CH2CN Si CH2CH2CH2NH2 Si CH2CH2CH2OCH OH CH2 OH 修饰后的Si 16 相互作用力是什么 OH HO SiOH SiOH 强 弱 or 非常弱 氢键 17 氢键力 如果样品有 COOH 羧基 NH2 氨基 OH 羟基氢键力变强 如果样品没有任何官能团 如碳水化合物如果样品有大的基团 由于空间障碍氢键力变弱 18 正相模式下流动相的选择 主要试剂烷烃 戊烷 己烷 庚烷 辛烷 芳香烃 苯 甲苯 二甲苯 二氯甲烷氯仿四氯化碳辅助试剂甲基 t 丁基醚 MTBE 乙醚 四氢呋喃 THF 二氧杂环乙烷 嘧啶 乙酸乙酯 乙腈 丙酮 异丙醇 乙醇 甲醇为了调整保留时间 可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂 19 增加溶剂极性 0 2 5 MeOH 1 邻苯二甲酸二辛酯2 邻苯二甲酸二丁酯3 邻苯二甲酸二乙酯4 邻苯二甲酸二甲酯 溶剂 己烷 20 反相液相色谱流动相极性大于固定相极性分离机制 疏水性 键合相色谱 反相色谱 21 反相液相色谱固定相 键合的烷基或苯基等非极性固定相流动相 水 有机溶剂 缓冲液等极性溶剂键合相链越长 疏水性越强 溶质的保留值增大流动相表面张力越大 介电常数越大 极性越强 溶质与键合相的作用越强 流动相的洗脱能力越差 溶质保留值越大 溶质的极性越弱 疏水性越强 保留值越大 键合相色谱 反相液相色谱 22 分离物质 能溶于水 有机溶剂混合液的中性或非离子化合物烷基柱 C8 C18 可分离中等极性的化合物 溶于水的高极性化合物 如 小肽 蛋白质 甾族化合物 类固醇 核碱 核苷 核苷酸 极性合成药物等苯基柱 C6H5 可分离非极性至中等极性的化合物 如 脂肪酸 甘油脂 多核芳烃 酯类 邻苯二甲酸酯 脂溶性维生素 甾族化合物 类固醇 PTH衍生化氨基酸等 键合相色谱 反相液相色谱 23 HPLC反相柱 C18 ODS typeC8 octyl typeC4 butyl typePhenyltypeTMStypeCyanotype Si C18H37 Si 非极性 24 相互作用力是什么 OH OH C18 ODS 强 弱 疏水性相互作用 25 疏水性 如果样品有CH3CH2CH2 碳链 芳香基如果样品有 COOH 羧基 NH2 氨基 OH 羟基 疏水力变强 疏水力变弱 26 反相模式下流动相溶剂的选择 水 缓冲液 有机溶剂在有缓冲液的情况下 缓冲液的浓度和PH是非常重要的甲醇 乙腈和THF是常用的有机溶剂优化水 缓冲液 和有机溶剂的比例是非常重要的 27 溶剂极性降低对分离的影响 20 30 40 H2O 1 p Hydoxymethylbenzoate2 p Hydoxyethylbenzoate3 p Hydoxypropylbenzoate4 p Hydoxybutylbenzoate 有机流动相 MeOH 28 固定相的影响 C18 ODS 强 C8 样品 样品 样品 C4 媒介 弱 29 固定相的影响 分析条件柱 Shim packCLC ODS流动相 MeOH H2O 7 3流速 1 0mL min温度 40C进样体积 10uL检测器 UV 254nm峰1 苯甲酸甲脂2 苯甲酸乙脂3 n 丙基苯甲酸4 n 丁基苯甲酸 ODSC8TMS 30 反相保留时间重复性好固定相耐用正相对立体异构体有很好的分离 VitaminE等 保留时间有变化 反相模式与正相模式的对比 31 离子对色谱法原理离子对色谱法是将一种 或数种 与溶质离子电荷相反的离子 称对离子或反离子 加到流动相或固定相中 使其与溶质离子结合形成离子对 从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法 关于离子对色谱机理 至今仍不十分明确 已提出三种机理 离子对形成机理 离子交换机理 离子相互作用机理 键合相色谱 离子对色谱 32 键合相色谱 离子对色谱 阴离子化合物氢氧化四丁基铵溴化四丁基铵阳离子化合物丁烷基磺酸钠 C4 戊烷基磺酸钠 C5 己烷基磺酸钠 C6 庚烷基磺酸钠 C7 辛烷基磺酸钠 C8 癸烷基磺酸钠 C10 十二烷基磺酸钠 SDS 33 分析对象有机酸 碱 盐离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物药物分析如生物碱 磺胺类药物 某些抗生素 维生素 键合相色谱 离子对色谱 34 反相离子对色谱法 离子对试剂 35 离子对色谱分离羧酸 36 离子对色谱分离含氨基的化合物 分析条件柱 Shim packCLC ODS流动相 A B 9 1 A 100mM磷酸缓冲液 pH 2 1 0 8mM辛烷磺酸钠 B 乙腈流速 1 5mL min温度 40C进样体积 10uL Peaks1 Nicotinicacid6 Thiamine2 Nicotinamide7 Caffeine3 Pantothenate8 Folicacid4 Pyridoxine9 Biotin5 Riboflavin10 RiboflavinPhosphate 37 离子对重点考虑 离子对试剂的类型离子对试剂的浓度溶剂的pH 38 离子对试剂的类型 己烷磺酸盐戊烷磺酸盐 39 离子对试剂的浓度 40 影响离子对色谱分离选择性的因素1 溶剂的极性2 离子强度 反相色谱中 离子强度增加 溶质k 值降低 正相色谱中 离子强度增加 溶质k 值增加 3 pH值 反相色谱中 pH值降低 阴离子溶质k 值降低 正相色谱中 pH值增加 阴离子溶质k 值增加 4 温度5 离子对试剂的性质和浓度 键合相色谱 离子对色谱 41 离子抑制色谱通过向流动相中加入少量弱酸 常用醋酸 弱碱 常用氨水 或缓冲盐 常用磷酸盐和醋酸盐 调节流动相的pH值 增加组分在固定相中的溶解度 并改善峰形 以达到分离有机弱酸 弱碱的目的 键合相色谱 离子抑制色谱 42 影响离子抑制色谱分离选择性的因素1 pH值 对于弱酸 pHpK值时 组分以离子形式存在 k值减小 对于弱碱 情况相反 2 温度3 离子抑制试剂的性质和浓度的影响 键合相色谱 离子抑制色谱 43 分离对象适合于3 08 0的碱 应采用离子对色谱法或离子交换色谱法 强酸强碱 离子抑制色谱缺点是重复性较差 键合相色谱 离子抑制色谱 44 键合相色谱 离子对色谱和离子抑制色谱的区别 1 添加物质不同离子抑制色谱法向流动相中添加抑制剂抑制自身解离 所添加的抑制剂为低分子有机或无机弱酸 弱碱 盐 抑制离子为样品本身具有的离子 离子对色谱法是向流动相中加入离子对试剂 离子对试剂为有机两性化合物 表面活性剂 2 分析对象不同离子抑制色谱法适于分离弱酸 弱碱 有机盐 两性化合物 弱酸 弱碱与分子化合物共存时的分离离子对色谱法用于有机强酸 碱的分离 45 离子交换色谱法 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法 凡在溶液中能够电离的物质 通常都可用离子交换色谱法进行分离 它不仅适用无机离子混合物的分离 亦可用于有机物的分离 例如氨基酸 核酸 蛋白质等生物大分子 应用范围较广 46 1 离子交换原理离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的 其固定相采用离子交换树脂 树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子 当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换 其交换反应通式如下 R一A B R B A阳离子交换 离子交换色谱法 阴离子交换 47 对于典型的磺酸型阳离子交换树脂 一价离子的KB A值按以下顺序 Cs Rb K NH4 Na H Li 二价离子的顺序为 Ba2 Pb2 Sr2 Ca2 Cd2 Cu2 Zn2 Mg2 不同价离子 价态越高 选择性系数越大对于季铵型强碱阴离子交换树指 各阴离子的选择性顺序为 ClO4 I HS04 SCN NO2 Br CN Cl BrO3 OH HCO3 H2P04 IO3 CH3COO F 离子交换色谱法 48 离子交换色谱法 2 固定相作为固定相的离子交换剂 其基质大致有三大类 合成树脂 聚苯乙烯 纤维素和硅胶 而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分 再根据官能基的离解度大小还有强弱之分 49 3 流动相离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度 或离子强度 的缓冲溶液 通过改变流动相中盐离子的种类 浓度和pH值可控制k值 改变选择性 如果增加盐离子的浓度 则可降低样品离子的竞争吸附能力 从而降低其在固定相上的保留值 离子交换色谱法 50 阴离子的滞留次序为 柠檬酸离子 SO42 C2O42 I NO3 CrO42 Br SCN Cl HCOO CH3C00 OH F 用柠檬酸离子洗脱要比氟离子快 阳离子的滞留次序为 但差别不如阴离子明显 Ba2 Pb2 Ca2 Ni2 Cd2 Cu2 Co2 Zn2 Mg Ag Cs Rb K NH4 Na H Li十流动相电离度增大 就会使样品的保留增大 关于pH值的影响 要视不同情况而定 例如 分离有机酸和有机碱时 这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制 增大pH值会使酸的电离度增加 使碱的电离度减少 降低PH值 其结果相反 离子交换色谱法 51 离子交换模式 N R R R 样品 SO3 样品 离子吸引力 52 离子交换模式 生物领域 蛋白质 农药 氨基酸分析 离子色谱阳离子交换剂强阳离子交换剂 SCX R SO3 弱阳离子交换剂 WCX R COO 阴离子交换剂强阴离子交换剂 SAX R4N 弱阴离子交换剂 WAX DEAE 53 用WCX柱进行蛋白质分析 分析条件柱 Shim packWCX 1流动相 A 20mMphosphatebuffer pH 6 0 B A 0 25Msodiumsulfate A B 30minlineargradient流速 1 0mL min温度 室温检测器 UV 280nm进样量 10uL峰1 白蛋白2 肌球素3 a 糜蛋白酶原A4 liponucleaseA5 lisozyme 54 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法 由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制 例如 对于那些不能采用紫外检测器的被测离子 如采用电导检测器 由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测 为了解决这一问题 1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术 他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱 抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相 从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量 这种色谱技术称为抑制型离子色谱 离子色谱法 55 若样品为阳离子 用无机酸作流动相 抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂 当试样经阳离子交换剂的分离往后 随流动相进入抑制柱 在抑制柱中发生两个重要反应 R OH H Cl R Cl十H2OR 一OH M Cl M OH R Cl 由反应可见 经抑制柱后 一方面将大量酸转变为电导很小的水 消除了流动相本底电导的影响 同时 又将样品阳离子M 转变成相应的碱 由于OH 离子的淌度为Cl 离子的2 6倍 提高了所测阳离子电导的检测灵敏度 对于阴离子样品也有相似的作用机理 离子色谱法 56 抑制型离子色谱仪 非抑制型离子色谱仪 离子色谱法 57 离子色谱法 抑制器技术的种类 76 81填充柱 再生液 81 85中空纤维85 92膜类型 抑制液 92 现在膜类型 电透析 岛津公司目前方式填充柱 电化再生 58 离子色谱法 膜类型 电透析 抑制器 59 离子色谱法 填充柱 电化再生 抑制器 NaHCO3 树脂 SO3 H 树脂 SO3 Na H2CO3 60 填充柱 固相化学抑制 1 带有10通阀的双抑制柱能提供连续进样分析 2 小体积的抑制柱使死体积更小电化学再生 1 不需要抑制液 不需额外填加泵 2 非常简单的更换抑制柱和维护简便且价格低 离子色谱法 填充柱 电化再生 抑制器 61 离子色谱法 抑制器 膜类型电透析填冲柱 固相化学抑制 用电化方法再生 shimadzu 优点缺点电透析 不需填加泵 高价格填充柱 不需填加泵 需要再生 低价格 62 亲和色谱法 AC 分离机制亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力 进行选择性分离的一种方法 它通常是在载体 无机或有机填料 表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂 如环氧 联氨等 随后 再连接上配基 酶 抗原或激素等 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留 没有这种作用的分子不被保留 63 亲和色谱法 AC 64 分离物质主要用于分离纯化具有不同分子量的生物活性物质 如氨基酸 肽 蛋白质 核碱 核苷 核苷酸 核糖核酸和脱氧核糖核酸等 优点分离的高特效性高选择性高回收率和纯化率 亲和色谱法 AC 65 尺寸排阻色谱法 SEC 尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法 主要用于较大分子的分离 与其他液相色谱方法原理不同 它不具有吸附 分配和离子交换作用机理 而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的 凝胶渗透色谱 GPC GelPermeationChromatography 流动相为有机溶剂凝胶过滤色谱 GFC GelFiltrationChromatography 流动相为水溶液 66 SEC原理 无相互作用力流出时间不同 67 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级 即用来分析大分子物质相对分子质量的分布 它具有其他液相色谱所没有的特点 1 保留时间是分子尺寸的函数 有可能提供分子结构的某些信息 2 保留时间短 谱峰窄 易检测 可采用灵敏度较低的检测器 3 固定相与分子间作用力极弱 趋于零 由于柱子不能很强保留分子 因此柱寿命长 4 不能分辨分子大小相近的化合物 相对分子质量差别必须大于10 才能得以分离 尺寸排阻色谱法 SEC 68 分离原理尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法 其固定相为化学情性多孔物质 凝胶 它类似于分子筛 但孔径比分子筛大 凝胶内具有一定大小的孔穴 体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻 较早地被淋洗出来 中等体积的分子部分渗透 小分子可完全渗透入内 最后洗出色谱柱 这样 样品分子基本上按其分子大小 排阻先后由柱中流出 尺寸排阻色谱法 SEC 69 固定相排阻色谱固定相种类很多 一般可分为软性 半刚性和刚性凝胶三类 所谓凝胶 指含有大量液体 一般是水 的柔软而富于弹性的物质 它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体 尺寸排阻色谱法 SEC 70 1 软性凝胶如葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构 其微孔能吸入大量的溶剂 并能溶胀到它们干体的许多倍 它们适用以水溶性溶剂作流动相 一般用于小分子质量物质的分析 不适宜用在高效液相色谱中 2 半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯 Styragel 比软性凝胶稍耐压 溶胀性不如软性凝胶 常以有机溶剂作流动相 用于高效液相色谱时 流速不宜大 3 刚性凝胶如多孔硅胶 多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂 又可用有机溶剂作流动相 可在较高压强和较高流速下操作 一般控制压强小于7MPa 流速 1cm3 s 1 否则将影响凝胶孔径 造成不良分离 尺寸排阻色谱法 SEC 71 流动相排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品 并必须与凝胶本身非常相似 这样才能润湿凝胶 当采用软性凝胶时 溶剂也必须能溶胀凝胶 另外 溶剂的粘度要小 因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果 这对于具有低扩散系数的大分子物质分离 尤需注意 选择溶剂还必须与检定器相匹配 常用的流动相有四氢呋喃 甲苯 氯仿 二甲基酸胺和水等 以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品 尺寸排阻色谱法 SEC 72 GPC GFC的目的 GPC 凝胶渗透色谱 主要用于聚合物科学领域聚合物分子量测量GFC 凝胶过滤色谱 主要用于生命科学领域蛋白质分离 73 流出顺序 74 MW和RT的关系 75 SEC校正曲线 分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离 76 校正曲线 依次进入标准聚合物来确认分子量和保留时间的关系 77 实际样品注射 计算MW 要求GPC软件 78 使用GFC柱进行蛋白质的分离 分离条件柱 AsahipakGFA 50流动相 0 1Msodiumphosphate0 1MNaCl pH 7 0 流速 0 5mL min温度 室温检测器 UV 280nm进样体积 10uL峰1 glutamatedehydrogenase2 lactatedehydrogenase3 enolase4 adenylatekinase5 cytochromeC 79 液相色谱分离模式选择指导图 80 液相色谱柱 81 通常 以指定的一组标准溶质为样品 测定他们在柱子上的理论塔板数 作为柱效的衡量指标 标准溶质的选择 不同柱子选择不同 但要求他们有不同的容量因子 第一个化合物的k 0 其余的在2 10内 能反映出柱子的基本性能理论塔板数 液相色谱柱 柱性能评价 82 特别注意的是 新购买的柱子在实验室中所测定的柱效 往往低于生产厂家给出的柱效 排除保存和运输过程中引起的柱性能变化等因素外 柱外效应可能是最主要的原因 只要将死体积减至最小 进样阀至柱头 柱头至检测器的连接管 一般可以得到满意的色谱图 液相色谱柱 柱性能评价 83 与柱子有关的一些常数 保留体积VR 保留时间tR绝对保留体积V R 绝对保留时间t R死体积V0 不保留溶质的保留体积死时间t0 不保留溶质的保留时间死体积 柱外体积 柱体积对于常规柱及制备柱 柱外体积可忽略 对于微型柱 柱外体积影响很大 必须尽量降低柱外体积 84 柱效率理论塔板数 与柱子有关的一些常数 理论塔板高度H L N 85 容量因子 capacityratio k 表征色谱柱中溶质的迁移速度k V R V0 t R t0 与柱子有关的一些常数 86 分离因子表征两种不同的溶质在柱子中的分离过程 kA kB 与柱子有关的一些常数 87 液相色谱检测原理 液相色谱检测器是用于连续监测被色谱系统分离后的柱流出物的组成和含量变化的装置 检测器的性能好坏直接关系着定性定量的可靠性和准确性 88 检测器分类按测量信号性质的不同浓度敏感型检测器响应正比于溶质在流动相中的浓度 与峰高响应流动相流速无关 峰面积响应与流速呈反比 峰面积与流速乘积为常数 大部分的液相检测器为浓度敏感型检测器质量敏感型检测器响应正比于单位时间内通过检测器的溶质的物质的量 即正比于质量流速 峰面积响应与流动相流速无关 峰高响应与流速呈反比 库仑检测器为质量敏感型检测器 液相色谱检测器 89 检测器分类按测量原理光学检测器电学检测器电化学检测器热学检测器 液相色谱检测器 90 检测器 通用型检测器示差折光检测器 RID 质谱检测器 MS 蒸发光散射检测器 ELSD 选择型检测器紫外 可见光检测器 UV VIS 光电二极管阵列检测器 PDA 荧光检测器 RF 电导检测器 CDD 电化学检测器 ECD 91 理想的检测器应具备的特点1 灵敏度高2 对所有组分都有响应3 不受温度和流动相流速变化的影响4 线性范围宽5 噪音低 漂移小 对流动相组分的变化不敏感 6 死体积小 不引起柱外效应 以保持高的分离效能 液相色谱检测器 92 7 对样品无破坏性8 响应快 能快速 精确地将流出物检测9 能给出定性的信息10 稳定 可靠 重现性好 使用方便11 价格便宜 液相色谱检测器 93 1 噪声 ND 无溶质通过检测器时 检测器输出信号的变化 是与被测样品无关的检测器输出信号随机扰动变化 短噪声 因信号频率波动引起 不影响色谱峰的分辨 但对检测限有影响 来源于仪器电子系统和泵的脉动 可以加适当的滤波器降低或消除长噪声 有规律的波动 基线呈波浪型 或无规律的波动 会引起色谱峰分辨的困难 由于检测器本身部件不稳定光路 流动相含有气泡或被污染 温度或流速引起 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 94 2 漂移基线随时间的增加朝单一方向的偏离造成漂移的原因是电源电压不稳 温度及流动相流速缓慢变化 固定相从柱子冲刷下来 更换的新溶剂在柱中尚未达到平衡 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 95 3 灵敏度S是检测器的主要性能指标一定量的物质通过检测器时所给出的信号大小叫做该检测器对该物质的灵敏度 S R m m为样品量增值 R为信号的增值响应信号可以是电压 电流 电导 吸光度AU 折光率RI等 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 96 检测器的响应曲线 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 97 1 同一检测器上 A B两种物质斜率不同 斜率越大 灵敏度越高 检测器的灵敏度和样品性质有关 因此该方法给出灵敏度时 需同时说明何种样品及何种溶剂 2 检测器限制了最大允许进样量 mmax 超过此限 响应信号不再与样品呈线性关系 3 灵敏度越高 检出限越低 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 98 灵敏度的定义只考虑了样品响应信号的大小 并没有考虑检测器的噪声 当检测器响应与噪声大小相近时 就无法区分信号 而且信号可以用电子放大器任意放大 这样似乎可以任意提高检测器灵敏度 但放大信号同时也放大了噪声 因此灵敏度并不能很好的衡量检测器的质量 需要更全面的衡量指标 检测限 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 99 4 检测限 detectability D又叫敏感度 为响应值二倍噪声时所需的样品量D 2ND S检测限实际上为信噪比 它考虑了噪声的影响 因而更能全面的反映检测器的质量 检出限越小 检测器的检测能力越强 注意 计算检出限时 噪声与信号的单位要一致 并且要在同一衰减水平 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 100 5 线性范围 linerrange 为检测信号与被检测物质的质量呈线性关系的范围 以呈线性响应的样品量的上限和下限比值表示 线性范围的下限规定为噪声的两倍值时的样品量 线性范围的上限由实验测知 为信号与样品量不呈线性的转折点 线性范围为比值 无量纲 希望线性范围尽量大 可以同时测定大量和痕量的组分 非线性是由于电子和机械的缘故产生的 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 101 6 最小检测量和最低检测浓度mmin最小检测量为产生的信号等于二倍噪声时的进样量mmin 2RNmi hu2RN为二倍噪声时检测器的响应 mi为进样量 hu2为峰高最低检测浓度为一定色谱条件下 最小检测量与进样体积之比 Cmin mmin V 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 102 最小检测量与检出限的区别1 影响因素不同最小检测量除与检测器性能有关外 还与色谱条件有关 检测限与色谱条件无关 同一物质只与检测器性能有关 一般最小检测量要比检出限高1 2个数量级 色谱峰越窄 两者相差越小 2 它们的单位不同检测限单位为g ml或g s最小检测量为g 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 103 注意 流动相的流速 压力 温度以及其干净程度对检测器的噪声 漂移 响应值等参数都有很大的影响 液相色谱检测器 评价检测器的性能指标 104 1 池体积增大就增大了死体积 池体积大 使样品被流动相稀释 不仅降低了检测灵敏度 而且使峰变宽 2 池的结构也会影响峰展宽 一般检测池的体积应该小于色谱峰体积的十分之一 常规分析 检测池体积为8ul小体积高效柱 检测池体积应小于5ul微量色谱柱 检测池体积减小到1ul 液相色谱检测器 检测池对检测器的影响 105 应用最广的检测器 属于浓度敏感型检测器优点 1 灵敏度高 噪声低 线性范围宽2 对流动相基本无响应 受操作条件和外界环境变化影响小 流速和温度变化不敏感 可用于梯度洗脱 3 对样品无破坏性 可以用于制备色谱或与其他检测器串连 4 结构简单 使用方便缺点 1 仅适用于测定有紫外吸收的物质2 流动相必须选择无紫外吸收特性的检测器 紫外检测器 106 紫外检测器 原理 基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础 朗伯 比尔定律 A KCL测量时一般选择在对样品有最大吸收的波长下进行 以获得最大的灵敏度和抗干扰能力 同时要考虑流动相的紫外吸收性质 107 一些常用溶剂的紫外截至波长 紫外检测器 紫外检测器流动相的选择 108 紫外 可见光检测器 Ein Eout A eCl log Eout Ein l C 浓度 朗伯 比尔定律 A 吸收 池 109 紫外 可见光检测器 样品池 参比池 光电二极管 光电二极管 Ein Ein Ein 光栅 D2 W灯 l Eout 110 紫外 可见光检测器 A eCl log Eout Ein 吸收 浓度 线性范围 2 5 111 光谱图 275nm 208nm 275nm 208nm 112 影响紫外检测器噪声和漂移的因素灯能量光学元件气泡流动相和检测池温度变化泵的流量及压力波动 紫外检测器 113 影响紫外检测器线性范围的因素1 单色器的色散能力2 光电转换元件和其他电子元件的灵敏度3 狭缝宽度狭缝宽度大 光通量大 有利于灵敏检测 但线性范围小 狭缝过窄 会降低灵敏度 4 波长的选择 最好选择在被测物的最大吸收波长处 线性范围宽 而且检测的精确度 准确度都高 紫外检测器 114 二极管阵列检测器 115 二十一世纪标准检测器色谱定性依据 保留时间常规紫外检测器峰纯度二极管阵列检测器 二极管阵列检测器 116 样品池 512光电二极管阵列检测器 光栅 D2 W灯 二极管阵列检测器 一个元件检测一个波长下的所有吸收 117 二极管阵列检测器 时间 长波 吸收 色谱图 光谱图 118 二极管阵列检测器 可以用光谱图对未知峰进行定性可以进行峰纯度的检测 119 检验分离参数时可使用光谱图 2 3 1 1 壬二酸 2 安息香酸 3 硝基安息香酸 30 15 乙腈浓度 min 120 光谱鉴定 洗提顺序 Peak1 Peak2 Peak3 乙腈 30 15 Azelaicacid Benzoicacid Nitrobenzoicacid 121 优点1 采集三维谱图 可同时得到多个波长的色谱图2 可实时记录每个色谱峰的光谱图 并计算最大吸收波长3 峰纯度检验4 光谱库检索定性5 可以发现单波长检测时未测到的峰6 可以选择适当的测定波长 使两个没有分开的峰中的一个产生抑制 从而实现未分离峰的准确定量 二极管阵列检测器 122 原理 基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点 1 灵敏度极高 是最灵敏的检测器之一比紫外检测器约高2 3数量级2 选择性好 避免了不发荧光的基体成分对检测的干扰3 对温度和流速不敏感 可用于梯度洗脱4 线性范围宽 约为104 1055 受外界影响小 荧光检测器 123 缺点 仅适用于测定可产生荧光的物质 应用范围窄可检测物质 多环芳烃 霉菌毒素 酪氨酸 色氨酸 卟啉 儿茶酚氨等 具有对称共轭体系 注意某些可以引起荧光猝灭的物质对检测的干扰 如流动相中溶解的氧 卤素离子 重金属离子 硝基化合物等 荧光检测器 124 荧光检测器 hn1 hn2 A A A hn1 hn2 激发波长 EmissionWavelength 荧光 125 荧光检测池的设计 126 衍生化试剂 OPA伯胺衍生化试剂 CHO CHO o phthalaldhyde OPA R NH2 N R A A ADAM脂肪酸衍生化试剂 CHN2 9 anthryldiazomethane ADAM R COOH CH2OCOR 127 影响荧光强度的因素1 pH值对某些可离子化的荧光化合物影响很大2 溶剂的极性 极性增大 荧光增强3 溶液的温度 温度升高 荧光减弱4 样品浓度 浓度增大会引起样品分子间的猝灭效应增大 荧光检测器 128 示差折光检测器 原理 连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度 优点 通用型检测器 缺点 1 对温度变化敏感2 对压力变化敏感3 对溶剂组成变化敏感 不能用于梯度检测4 属于中等灵敏度的检测器 129 示差折光检测器 光学系统 130 示差折光检测器 131 糖的色谱图 分析条件柱 Shim packCLC NH2流动相 Acetonitrile water 7 3流速 1 0mL min温度 室温Peaks1 甘油l2 木糖醇3 果糖4 葡萄糖5 蔗糖6 乳糖7 乳糖 132 电导检测器 原理 根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量 广泛应用于离子色谱法优点 对流动相流速和压力的改变不敏感 可用于梯度洗脱缺点 对温度变化敏感 每升高1度 电导率增加2 2 5 主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子 133 蒸发光散射检测器 检测原理一定条件下粒子的数量不变 光散射强度正比于由溶质浓度决定的粒子的大小来进行测量 光散射的程度取决于散射室中溶质粒子的大小和数量 粒子的数量取决于流动相的性质以及喷雾气体和流动相的线性流速及体积流速 如果流动相和流速相同 则颗粒的大小由微粒中的溶质浓度决定 134 蒸发光散射检测器的调节参数1 雾化载气流压力雾化载气流压力影响雾化器中液滴的形成从而影响检测器的响应 信噪比随压力升高而升高 在某一压力达到最佳值 不同载气的最佳信噪比压力是不同的 雾化载气流压力可以用载气流量表示 2 蒸发器温度温度升高 流动相蒸发趋向完全 检测器响应增大 信噪比上升 但温度过高 可能导致检测组分部分气化而使信号变小 不同流动相有不同的蒸发器合适的设定温度 蒸发光散射检测器 135 不同流动相的蒸发器温度设定 蒸发光散射检测器 136 蒸发光散射检测器的优点1 通用型检测器2 灵敏度高3 对流动相系统的温度变化不敏感4 受流动相溶剂的影响小 可以用作梯度洗脱 而且梯度洗脱时基线不漂移5 无需测定定量校正因子 因为它的响应值仅取决于溶质颗粒的大小和数目 对所有的组分响应几乎相等 蒸发光散射检测器 137 蒸发光散射检测器的缺点1 样品组分需是非挥发性或半挥发性的2 流动相需是易挥发性的3 流动相缓冲盐必须是挥发性的 常用的缓冲盐有 甲酸 乙酸 三氟乙酸 硝酸铵和磷酸氢二铵等 蒸发光散射检测器 138 电导检测器 I V L A A K 电导率 I A E V A cm2 L cm xk k 特殊电导率 k I E x L A 电极 139 电导检测器 温度对电导率有很大的影响 必须将检测池置于恒温装置中 140 分析条件柱 Shim packIC A3流动相 8 0mMp hydroxybenzoicacid3 2mMBis Tris 流速 1 5mL min温度 40C进样量 100uLPeaks1 F 1 4ppm 2 Cl 10200ppm 3 NO2 10ppm 4 Br 43ppm 5 NO3 44ppm 6 SO4 431ppm 尿液中阴离子的色谱图 Bis Tris bis 2 hydroxyethyl iminotris hydroxymethyl methane 141 电化学检测器 工作电极 辅助电极 参比电极 142 ECD检测器的原理 应用 GC 苯酚类化合物一般使用Pt H2O2Ag 卤素离子Au 糖分析 143 儿茶酚胺类物质的色谱图 分析条件柱 Shim packCLC ODS流动相 80mMphosphatebuffer pH 2 7 100mMNaNO3 200mg lSOS5mg lEDTA 4 acetonitrile流速 1 0mL min使用电压 0 8V温度 40C进样量 10uLPeaks1 去甲肾腺上素 5ppb 2 肾腺上素 5ppb 3 多巴胺 5ppb 144 LCMS大气压离子化 电喷雾 ESI 大气压下化学电离 APCI H i g h V o l t a g e 3 C o u l o n E x c l u s i o n I o n E v a p o r a t i o n 2 E v a p or a t i o n o f S o l v e n t i q u i S a m p l e s L i q u i d S a m p l e s H e a t e r C o r o n a D i s c h a r g e N e e d l e Ionmolecularreaction Nebulizinggas Nebulizinggas 145 LCMS的设计 146 可以分析哪种类型的化合物 ESI药物及其代谢物农药蛋白质多种天然产品 OH NH2 COOH SO2 PO3etc APCI农药类固醇药物 147 农药的分析 148 农药的分析 质谱图 149 不同检测器的比较 LOD 检测限 S N 3 GC 梯度兼容性PDA的灵敏度稍低于紫外检测器的灵敏度 UV VIS RF RID CDD ECD MS LOD 1ppb 10ppt 100ppb 1ppb 10ppt 1ppb GC Yes Yes No No No Yes 150 如何用好HPLC 得到好结果的技巧 151 流动相缓冲液 溶剂选择 梯度优化 流速选择脱气 流速稳定 流动相制备柱高柱效 二级作用力 温度控制检测灵敏度 选择性 温度波动影响样品提取方法选择 样品溶剂选择 氧气影响仪器性能 稳定性 耐用性 易操作性综合评估分析技术的稳定性 可靠性 定量准确性 HPLC如何得到好的结果 152 流动相 溶剂混和率及其制备 1 下面的两种配制一样吗 水 乙醇 1 1 v v 50 v v 乙醇水溶液 混和有机溶剂时注意体积变化混和液的密度不是两种溶剂密度的简单相加 25 C时 50mL水和50ml乙醇混和 最终体积为96ml 153 水 乙醇 1 1 v v 分别量取500ml水和乙醇 然后混和混和体积不是1L 50 v v 乙醇水溶液 加500ml乙醇于1L的容量瓶中 加水至刻度 水的比例更高 流动相 溶剂混和率及其制备 2 154 流动相A 20mM磷酸 Na 缓冲液 乙腈 9 1 v v 流动相B 10 v v 乙腈 20mM磷酸缓冲液 1 2 3 3 1 A B 2 Peaks1 acetaminophen2 dihydrocodeine3 caffeine 0 2 4 6 8 10 min Column Shim PackVP ODS 150mmL x4 6mmI D Flowrate 1mL minTemp 40 CDetection UV VIS 210nm 流动相 溶剂混和率及其制备 3 155 配制 20mM磷酸缓冲液 pH2 5 流动相 缓冲液比例及其制备 1 A 20mM 表示磷酸浓度 加10mmol磷酸和10mmol磷酸二氢钠 溶解与1L水中B 20mM 表示钠浓度 溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中 加磷酸调pH至2 5C 20mM 表示磷酸和钠的浓度 用高氯酸调节pH 溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中 用高氯酸调节pH至2 5 156 Column Shim PackVP ODS 150mmL x4 6mmI D Flowrate 1mL minTemp 40 CDetection UV VIS 210nm 流动相A 磷酸浓度为20mM流动相B 钠浓度为20mM流动相C 磷酸 钠浓度均为20mM 用高氯酸调节pH 流动相 缓冲液比例及其制备 2 min 1 2 3 3 1 A B 2 Peaks1 acetaminophen2 dihydrocodeine3 caffeine 0 2 4 6 8 10 C 3 1 2 不一样的解释 Dihyrocodeine出峰位置不一样 157 流动相缓冲能力弱 pKa与流动相pH相近的酸和碱的峰形变差 Column STRODS II 150mmL x4 6mmI D Mobile 20mMbuffersolution pH4 5 phase acetonitrile 3 1 v v Flowrate 1mL minTemp 40 CDetection UV VIS 240nm 左图 柠檬酸缓冲液pH 4 5 作流动相右图 磷酸缓冲液 pH4 5 作流动相 流动相 pH缓冲能力和峰形 158 常见缓冲体系的pKa值 159 吸光度 HPLC级的乙腈在UV低波长有很低的吸收HPLC级的乙腈适用于UV低波长下高灵敏度的分析 柱压 乙腈更低 相同流速下 引起的柱压更低 洗脱能力 乙腈更强 一些化合物甲醇容易洗脱 胡萝卜素 胆固醇 选择性 不同 峰形 不同 聚合物基底的柱子 乙腈更好 流动相脱气效率 与水混和时要注意甲醇 发热 气体溢出乙腈 吸热 气体溶解 流动相 甲醇和乙腈的不同 160 保留时间改变峰面积改变 定量错误 对绝对量响应的检测器 流速不影响峰面积 对浓度响应的检测器 流速影响峰面积 几乎所有的LC检测器均为浓度型检测器 流动相 流速变化的影响 1 161 Column Shim PackVP ODS 150mmL x4 6mmI D Mobilephase methanol water 6 4 v v Flowrate A 1 00mL minB 0 99mL minTemperature 40 CDetection UV VIS 260nm 流动相 流速变化的影响 2 162 两台泵进行混和时 A B A 一台泵输送预先混和好溶剂B 两台泵分别输送两种溶剂并混和 Peaks1 methylparaben2 ethylparaben3 propylparaben 1 2 3 流动相 高压梯度时流速变化的影响 1 保留时间和预先混和好的溶剂不同 163 Column Shim PackVP ODS 150mmL x4 6mmI D Mobilephase methanol water 6 4 vol vol Flowrate 1 00mL minTemperature 40 CDetection UV VIS 260nm 流动相 高压梯度时流速变化的影响 1 A 一台泵输送预先混和好溶剂B 两台泵分别输送两种溶剂并混和 164 气泡出现的原因当溶解的空气超过空气的溶解度时 原因 溶剂温度升高 压力降低 溶剂混和等 气泡可能引起的问题流动相 泵保留时间波动 流动相流量不稳定柱峰变形 柱效降低检测器产生噪声解决方法 离线和在线脱气然而 问题不仅由于气泡引起 而且由于溶解的空气引起 流动相 流动相中的气泡引起的问题 165 荧光检测器氧气引起荧光猝灭 改变峰面积吸光型检测器改变背景吸收 基线波动 特别是在梯度洗脱时 氧气吸收峰出现所谓的溶剂吸收峰示差折光检测器基线波动 流动相 流动相中的空气对检测器的影响 166 荧光检测器分析bisphenolA脱气 氦脱气 流动相 荧光检测中脱气的影响 1 流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度 167 脱气时间对气 液半透膜脱气效果的影响 Column Shim PackVP ODS 150mmLx4 6mmI D MobilePhase acetonitrile H2O 4 1 v v Flowrate 1mL minTemperature 40 C Analyte PyreneDetection Fluorescence Ex310nm Em390nm Degassing Gas liq separationmembrane 流动相 荧光检测中脱气的影响 2 168 甲醇吸收光谱图 如果溶解的氧气浓度高 有机溶剂的吸光度液也 在短波长区影响更为明显 流动相 UV检测器的背景变化 饱和空气 脱气 169 进流动相引起出峰 流动相 溶解的空气引起UV检测器的出峰 Detection UV 210nm 流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰 流动相脱气 流动相没脱气 OxygenbubblingAirsaturationHebubbling OxygenbubblingAirsaturationHebubbling 170 放大 流动相 溶解空气引起