酶分离纯化过程中需要注意什么问题？为什么进行酶活力、酶比活力的测定.ppt

酶的分离与纯化 ppt制作 朱杰明ppt讲解 尹聪翔资料查找 陈荣威 酶在分离纯化中应注意的问题 酶活力 酶比活力 酶活回收率 酶比活力提高比 酶的分离与纯化 目录 酶的提取 分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物 植物或微生物细胞 离心分离 过滤分离 沉淀分离 层析分离 电泳分离 萃取分离 结晶分离等 根据酶提取时 所采用的溶剂或溶液的不同 酶抽提的方法主要有盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取等 2 酸溶液提取 有些酶在酸性条件下溶解度比较大 且稳定性好 宜用酸溶液提取 提取时需注意溶液的pH不能太低 以免酶变性失活 如胰蛋白酶可用0 12mol l硫酸溶液提取 1 盐溶液提取 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下 酶的溶解度增加 即盐溶 但盐浓度不能太高 否则溶解度反而降低 即盐析 故 一般采用稀盐溶液进行酶的提取 盐浓度控制在0 02 0 5mol L 如淀粉酶 蛋白酶等胞外酶0 14mol l氯化钠溶液提取 3 碱性溶液提取 有些酶在碱性条件下溶解度较大 且稳定性较好 宜用碱溶液提取 操作时注意pH不能过高 以免影响酶活 同时加碱液时要一边搅拌一边缓慢加进 避免局部过碱而引起酶变性失活 4 有机溶剂提取 有些酶与脂类物质结合牢固或含有较多非极性基团 可采用与水可以混溶的乙醇 丙酮 丁醇等有机溶剂提取 影响酶分离纯化的主要因素 1 温度 提取时的温度对酶的提取效果有明显影响 一般来说 适当提高温度 可提高酶的溶解度 但温度过高则容易引起酶的变性失活 所以提取时温度不宜过高 特别是采用有机溶剂提取时 温度应控制在0 10 的低温条件下 2 pH 溶液的pH对酶的溶解度和稳定性有显著影响 在达到酶等电点时的pH值下 酶分子的溶解度最小 为了提高酶的溶解度 提取时pH应避开酶的等电点以提高酶的溶解度 3 提取液的体积 增加提取液的用量 可以提高酶的提取率 但是过量的提取液会使酶的浓度降低 对进一步的分离纯化不利 所以提取液的总量一般为原材料的3 5倍 最好分多次提取 4 添加保护剂 加入适量的酶作用底物 辅酶或抗氧化剂可以提高酶稳定性 减少酶活损失 酶活力 酶活力也称为酶活性 是指酶催化一定化学反应的能力 酶活力的大小可用在一定条件下 酶催化某一化学反应的速度来表示 酶催化反应速度愈大 酶活力愈高 反之活力愈低 测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度 酶促反应速度可用单位时间内 单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示 一般以产物增量来表示酶促反应速度 1个酶活力单位是指在特定条件下 在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量 或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量 酶活力的测定方法 1 终点法 测定完成一定量反应所需的时间 如 淀粉酶的活力测定 因为碘对淀粉呈现蓝色反应 当淀粉溶液中加入淀粉酶后 碘的蓝色反应消失而呈现红棕色 碘对淀粉颜色反应消失的时间可表示淀粉酶活力的大小 2 动力学方法 测定一定时间内所起的化学反应量 比色法如果酶反应的产物可与特定的化学试剂反应而生成稳定的有色溶液 且生成颜色的深浅与产物的浓度在一定的范围内有线性关系可用此法 量气法主要用于有气体产生的酶促反应 如氨基酸脱羧酶 脲酶的活力测定 产生的二氧化碳量可用特制的仪器如瓦氏呼吸仪测定之 根据气体变化和时间的关系 即可求得酶反应的速度 滴定法如果产物之一是自由的酸性物质可用此法 如脂肪酶催化脂肪水解 脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力 分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同 可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量 几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定 放射测量法是酶活力测定中较常用的一种方法 一般用放射性同位素标记底物 在反应进行到一定程度时 分离带放射性同位素标记的产物并进行测定 就可测知反应进行的速度 测定酶活力需测定其初速度 如图所示 曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化 所以曲线上任何一点的斜率就是该相应时间的反应速率 随着时间的延长 曲线逐渐平坦 斜率降低 反应速度也就降低 显然这个时候测得的酶活力不能代表真实的酶活力 引起酶促反应速率随时间延长而降低的原因很多 如底物浓度降低 产物浓度增加加速了逆反应进行 产物对酶的抑制等等 因此 测定酶活力 应该测定酶促反应的出速率 从而避免上述种种复杂因素对反应速率的影响 酶比活力 酶比活力是在特定条件下 单位重量 mg 蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数 比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数 一般用u mg蛋白质表示 酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度 对于同一种酶来说 比活力越大 酶的纯度越高 利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力 是表示酶的纯度高低的一个重要指标 在酶的分离纯化过程中进行酶活力及酶比活力表测定的原因是 一方面 防止酶变性失活 一旦活力明显下降 就要考虑换一种纯化方法 另一方面 计算纯化效率 通过总活力和比活 评估纯化效率 寻找最佳方法 酶活回收率与酶比活力提高比 为防止酶在分离纯化过程中丧失活性 进行酶活回收率和酶比活力提高比的测定 1 酶活性回收率 反应提纯过程中酶活力的损失情况总活力水收率