色谱概论和经典液相色谱法-0904.ppt

分析化学 下篇 仪器分析部分主讲教师 彭缨 第十六章色谱分析概论 第一节色谱过程和基本原理 一 色谱法的由来1 1906年由俄国植物学家Tsweet创立植物色素分离见图示2 现在 一种重要的分离 分析技术分离混合物各组分并加以分析固定相 除了固体 还可以是液体流动相 液体或气体色谱柱 各种材质和尺寸被分离组分 不再仅局限于有色物质 图示 固定相 CaCO3颗粒流动相 石油醚 图示 一 色谱过程 一 色谱过程指被分离组分在两相中的 分配 平衡过程 以吸附色谱为例见图示吸附 解吸 再吸附 再解吸 反复多次洗脱 被测组分分配系数不同 差速迁移 分离 二 色谱法定义 实质 定义 利用物质的物理化学性质建立的分离 分析方法实质 分离 三 分类 1 按两相分子的聚集状态分 流动相固定相类型 续前 2 按固定相的固定方式分 3 按分离机制分 图示 色谱法简单分类 四 基本类型色谱法的分离机制 基本概念 固定相 s 流动相 m 一 吸附色谱法 二 分配色谱法 三 离子交换色谱法 四 空间排阻色谱法 一 吸附色谱法 要求 固定相 吸附剂 硅胶或AL2O3 具表面活性吸附中心分离机制 见图示 吸附系数 注 Ka与组分的性质 吸附剂的活性 流动相的性质及温度有关next 吸附平衡Xm nYa Xa nYm 图示 分离机制 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 吸附 解吸 再吸附 再解吸 无数次洗脱 分开back 图示 化学性质的微小差异 吸附能力的微小差异微小差异积累 较大差异 吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出back 固定相 吸附剂多孔性微粒状物质比表面积大 吸附中心多 硅胶表面硅醇基 流动相 有机溶剂 极性强洗脱能力强 洗脱顺序 1吸附中心的竞争2组分与固定相的作用3组分在流动相的溶解性 二 分配色谱法 要求 固定相 机械吸附在惰性载体上的液体流动相 必须与固定相不为互溶载体 惰性 性质稳定 不与固定相和流动相发生化学反应分离机制见图示 狭义分配系数 注 K与组分的性质 流动相的性质 固定相的性质以及柱温有关next 图示 分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离 连续萃取过程back 固定相 涂渍在在惰性载体材料上的液体又称固定液 化学键合相 流动相 1气体 氢气 氮气2液体 正相 反相 固定相与流动相极性相对强弱 洗脱顺序 组分在流动相固定相中的溶解度相对大小决定 三 离子交换色谱法 要求 固定相 离子交换树脂流动相 水为溶剂的缓冲溶液被分离组分 离子型的有机物或无机物分离机制见图示 选择性系数 阳离子交换树脂RSO3 H X RSO3 X H 注 Ks与离子的电荷数 水合离子半径 流动相性质 离子交换树脂性质以及温度有关next 图示 分离机制 依据被测组分与离子交换剂交换能力 亲和力 不同而实现分离back 四 空间排阻色谱法 要求 固定相 多孔性凝胶流动相 水 凝胶过滤色谱流动相 有机溶剂 凝胶渗透色谱分离机制见图示 渗透系数 注 Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小 与流动相的性质无关next 图示 分离机制 利用被测组分分子大小不同 在固定相上选择性渗透实现分离back 结论 四种色谱的分离机制各不相同 分别形成吸附平衡 分配平衡 离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数 狭义分配系数 选择性系数和渗透系数 除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸 凝胶孔径大小有关外 其他三种K值都受组分的性质 流动相的性质 固定相的性质以及柱温的影响 五 色谱法的特点 优点 三高 一快 一广 缺点 六 基本概念 一 色谱流出曲线和有关概念1 流出曲线和色谱峰2 基线 噪音和漂移3 保留值 色谱定性参数4 色谱峰高和峰面积5 色谱峰的区域宽度 色谱柱效参数6 分离度 1 流出曲线和色谱峰 流出曲线 色谱图 电信号强度随时间变化曲线色谱峰 流出曲线上突起部分 续前 不对称因子 fs在0 95 1 05之间 fs小于0 95 fs大于1 05 2 基线 噪音和漂移 基线 当没有待测组分进入检测器时 反映检测器噪音随时间变化的曲线 稳定 平直直线 噪音 仪器本身所固有的 以噪音带表示 仪器越好 噪音越小 漂移 基线向某个方向稳定移动 仪器未稳定造成 3 保留值 色谱定性参数 保留时间tR 从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间 即组分通过色谱柱所需要的时间死时间tm 不被固定相溶解或吸附的组分的保留时间 即组分在流动相中的所消耗的时间 或流动相充满柱内空隙体积占据的空间所需要的时间 又称流动相保留时间 调整保留时间tR 组分的保留时间与死时间之差值 即组分在固定相中滞留的时间 图示 保留体积VR 从进样开始到组分出现浓度极大点时所消耗的流动相的体积 死体积Vm 不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积 又指色谱柱中未被固定相所占据的空隙体积 即色谱柱的流动相体积 包括色谱仪中的管路 连接头的空间 以及进样器和检测器的空间 续前 调整保留体积VR 保留体积与死体积之差 即组分停留在固定相时所消耗流动相的体积 相对保留值ri s 选择性系数 调整保留值之比 续前 保留指数IX 指将待测物的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为 已知范围内组分的定性参数 4 色谱峰高和峰面积 峰高 组分在柱后出现浓度最大时的检测信号 峰面积 色谱曲线与基线间包围的面积 图示 5 色谱峰的区域宽度 色谱柱效参数 峰宽W 正态分布色谱曲线两拐点切线与基线相交的截距 标准差 正态分布色谱曲线两拐点距离的一半 对应0 607h处峰宽的一半注 小 峰 窄 柱效 高半峰宽W1 2 峰高一半处所对应的峰宽 注 除了用于衡量柱效 还可以计算峰面积 6 分离度定义式 分离度 相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍 衡量色谱分离条件优劣的参数 讨论 二 分配系数和色谱分离 分配系数和保留因子分配系数保留因子和保留时间的关系色谱分离的前提 1 基本术语 1 保留时间tR 从进样开始到某组分色谱峰顶 浓度极大点 的时间 即组分在色谱柱中的停留时间或组分流经色谱柱所需要的时间 2 死时间t0或tm 分配系数为零的组分的保留时间 即组分在流动相中的停留时间或流动相流经色谱柱所需要的时间 又称流动相保留时间 3 分配系数K 平衡常数 指在一定温度和压力下 组分在色谱柱中达分配平衡后 在固定相与流动相中的浓度比 色谱过程的相平衡参数 注 K为热力学常数与组分性质 固定相性质 流动相性质及温度有关实验条件固定 K仅与组分性质有关 4 保留因子 容量因子 容量比 分配比 k 指在一定温度和压力下 组分在色谱柱中达分配平衡时 在固定相与流动相中的质量比 更易测定 5 保留比R 衡量溶质分子在色谱柱上相对移行速度 2 tR与K的关系 续前 讨论 色谱条件一定时 tR主要取决K的大小 色谱法基本的定性参数 结论 色谱分离前提 各组分分配系数不等 注 应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等 2 色谱条件 s m T 一定时 K一定 tR一定 第三节色谱法基本理论 塔板理论速率理论 一 塔板理论 色谱柱每个H高度内有一块塔板 共有若干块塔板组分在每块塔板两相间分配达平衡 K小的先出柱多次分配平衡 K有微小差异组分仍可获较好分离 假想 一 塔板理论的四个基本假设 1 在柱内一小段高度内组分分配瞬间达平衡 H 理论塔板高度 2 分配系数在各塔板上是常数 3 流动相非连续而是间歇式 脉动式 进入色谱柱 每次进流动相一个塔板体积4 样品和流动相均加在第0号塔板上 且忽略样品沿柱方向的纵向扩散 图示 二 色谱峰的二项式分布 N较少 逆流分布 转移3次以后 3号塔板内溶质分数 图示 三 色谱峰的正态分布 N 50次 近似对称分布 讨论 四 理论板数和理论塔板高度的计算 理论塔板高度H 为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长理论塔板数N 组分流过色谱柱时 在两相间进行平衡分配的总次数 续前 续前 小结 1 塔板理论的贡献 从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置阐明了保留值与K的关系提出了评价柱效高低的n和H的计算式 在比较相似柱的柱效时有用须在给定条件 指定组分测定时才有意义 2 练习 例 在柱长为2m的5 的阿皮松柱 柱温为1000C 记录纸速度为2 0cm min的色谱条件下 测定苯的保留时间为1 5min 半峰宽为0 20cm 求理论塔板数 解 二 速率理论 一 塔板理论优缺点 二 VanDeemteer方程式 一 塔板理论优缺点 成功处 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR阐明了保留值与K的关系评价柱效 n 存在问题 1 做出了四个与实际不相符的假设忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2 只定性给出塔板高度的概念 却无法解释板高的影响因素3 排除了一个重要参数 流动相的线速度u 因而无法解释柱效与流速关系更无法提出降低板高的途径 二 VanDeemteer方程式 吸收了塔板理论的有效成果 H 并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素 流速与柱效的关系 1 涡流扩散项 多径扩散项 A 产生原因 载气携样品进柱 遇到来自固定相颗粒的阻力 路径不同 涡流扩散next 影响因素 固体颗粒越小 填充越实 A项越小 讨论 注 颗粒太小 柱压过高且不易填充均匀填充柱 60 100目空心毛细管柱 0 1 0 5mm A 0 n理较高next 图示 back 2 纵向扩散项 分子扩散项 B u 产生原因 峰在固定相中被流动相推动向前 展开 两边浓度差 讨论 3 传质阻抗项 C u 产生原因 组分分子与流动相和固定相分子相互作用的结果 样品被流动相溶解扩散转移的过程为传质 影响因素 续前 讨论 注 固定液应完全覆盖载体表面 不可以太薄 否则柱子寿命短 k太小 T不可以超过固定液最佳使用温度 小结 范氏方程说明了在色谱分离条件的选择中 填充均匀程度 填充物的粒度 流动相的种类及流速 固定相的液膜厚度等对柱效和峰展宽的影响 第三节色谱法的历史与展望 一 历史 30年代茨维特分离绿叶色素40年代TLC 纸色谱50年代GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代末HPLC出现 使色谱分析范围进一步扩大 二 展望 1 新型固定相和检测器2 联用仪器 GC MS HPLC MS3 智能化发展 第十九章平面色谱法 第一节平面色谱法的分类薄层色谱法纸色谱法薄层电泳法 第二节薄层色谱法 一 概述 二 吸附剂的选择 三 展开剂的选择 四 定性参数 五 薄层板的制备 六 定性与定量分析 一 概述 1 定义 将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法 2 操作过程 见图示铺板 活化 点样 展开 定位 定性 洗脱 定量 3 分离机制 吸附 分配 离子交换 空间排阻 4 特点 分析快速 灵敏 显色方便5 应用 药物杂质检查 纯度测定next 图示 图示 L0 L1 L2 分离原理各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离 二 常用吸附剂 多孔 微粒状物质1 硅胶2 氧化铝3 聚酰胺 1 硅胶 SiO2 H2O 结构 内部 硅氧交联结构 多孔结构表面 有硅醇基 氢键作用 吸附活性中心 特性 1 与极性物质或不饱和化合物形成氢键物质极性 吸附能力 强极性吸附中心 不易洗脱吸附活性次序 活泼型 束缚型 游离型2 吸水 失活 105 110OC烘干30分钟 可逆失水 吸附力最大 500OC烘干 不可逆失水 活性丧失 无吸附力 适用 分析酸性或中性物质 续前 2 氧化铝碱性氧化铝pH9 10适于分析碱性 中性物质中性氧化铝pH 7 5适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝pH4 5适于分析酸性 中性物质 3 聚酰胺氢键作用氢键能力 强 组分越后出柱 三 吸附剂和流动相的选择 依据被测组分 吸附剂和流动相的性质 1 被测组分性质 极性大小 烃 羧酸 醇2 吸附剂的活性 吸附剂的活性 大 对被测组分的吸附能力 强强极性物质 选择弱吸附剂弱极性物质 选择强吸附剂3 流动相的极性 流动相极性 大 对被测组分的洗脱能力 大 相似相溶 原则 根据组分性质 吸附剂的活性 选择适当极性的流动相 吸附剂的选择根据被测物极性和吸附剂的吸附能力被测物极性强 弱极性吸附剂被测物极性弱 强极性吸附剂 展开剂的选择 同液固吸附色谱流动相的选择 根据被测组分 吸附剂和展开剂本身的极性 续前 4 三者关系图示 组分吸附剂流动相极性活性小极性非 弱 极性活性大非极性或弱极性 图示 L0 L1 L2 四 定性参数 1 比移值Rf 续前 讨论Rf与K有关 即与组分性质 溶解度 以及薄层板和展开剂的性质有关色谱条件一定 Rf只与组分性质有关 是薄层色谱基本定性参数 说明组分的色谱保留行为 续前 1 K 大 Rf 小2 薄层板一定 对于极性组分展开剂极性 大 Rf 大 容易洗脱 展开剂极性 小 Rf 小 不容易洗脱 3 Rf范围 0 Rf 1 组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离 Rf 0 2 0 8 常用 0 3 0 5 最佳 续前 2 相对比移值Rs 讨论参考物与被测组分在完全相同条件下展开可以消除系统误差 大大提高重现性和可靠