非洲猪瘟病毒P72单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立.ppt

非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立 研究生 朱红导师 孙怀昌教授 研究背景 是由非洲猪瘟病毒 ASFV 引起猪的一种急性 热性 高致死性的传染病 强毒株感染的发病率和死亡率可达100 OIE将其列为国际A类疾病 在非洲国家广泛流行 无有效疫苗进行防治 非洲猪瘟 Africanswinefever 研究背景 形态特征 图1 复制方式 胞浆内分类 非洲猪瘟病毒科是唯一一种DNA虫媒病毒 非洲猪瘟病毒 ASFV 下一页 返回 有囊膜 二十面体对称 双股DNA病毒 病毒粒子堆积于胞浆中 平均直径200nm 结构复杂 中心部为一个电子密度大的类核体 周围为清晰的六角形外壳 基因组约为170 210kb 研究背景 研究背景 VP72参与病毒吸附和进入细胞的四种主要蛋白之一 占病毒粒子蛋白的32 是一种非常保守的抗原性蛋白 对自然感染具有免疫原性 是血清学检测的理想抗原 研究背景 常规实验室诊断技术血吸附试验敏感猪接种试验PCR免疫荧光ELISA 研究目的及意义 诊断的意义目前尚无理想的疫苗对非洲猪瘟进行预防 抗体诊断的目的发病猪产生的IgG抗体在体内能持续很长时间 特别适用于亚急性和慢性病例的检出 单克隆抗体的优势特异性强高效 灵敏 便捷 成本低 研究内容一 非洲猪瘟病毒P72单抗的制备 技术路线 免疫原的制备 重组细菌pGEX VP72 表达融合蛋白GST VP72 免疫小鼠 SDS PAGE电泳 定量 IPTG诱导 切胶 磨胶 泳道1 pGEX VP72未诱导全菌泳道2 pGEX VP72诱导沉淀M 蛋白质预染Marker 免疫用蛋白表达鉴定 检测用抗原的制备 重组细菌pGEX VP72S 表达GST VP72S 纯化GST VP72S 4 或 20 保存备用 IPTG诱导 GlutathioneSepharose4B 方阵滴定法 定量 包被96孔反应板 M 低分子量蛋白质marker1 未纯化的GST VP72s2 纯化过的GST VP72s M 蛋白质预染Marker泳道1 未诱导的pGEX VP72S泳道2 IPTG诱导的GST VP72S 检测用抗原的鉴定与纯化 筛选 结果筛选到五株阳性克隆 命名为3E9 3E11 4A8 4H2 6E5 方法 单克隆抗体的效价测定 结论 细胞上清效价在27 212之间 腹水效价可达216 单克隆抗体的亚类鉴定 结论 经亚类试剂盒鉴定 单抗的亚类为IgG2b 单克隆抗体的抗原识别 间接ELISADot ELISAWesternblotting 方法 间接ELISA结果 结论 与GST VP72s抗原反应呈阳性 与GST抗原反应呈阴性 Dot ELISA结果 1 6 GST VP72S为抗原 分别以3E9 3E11 4A8 4H2 6E5 阴性血清为一抗 7 12 GST为抗原 分别以3E9 3E11 4A8 4H2 6E5 阴性血清为一抗 结论 与GST VP72S抗原反应呈阳性 与GST抗原反应呈阴性 Westernblot M 低分子量蛋白质电泳marker1 抗原为复性的GST VP722 抗原为纯化的GST3 抗原为纯化的GST VP72s iELISA抗体检测方法的建立 研究内容二 抗原包被液的选择 结论 以碳酸盐缓冲液 pH9 6 包被效果最好 其次是PBS和生理盐水 0 05MTris cl pH8 6 包被效果较差 蒸馏水包被效果不理想 抗原包被条件及封闭液的选择 结论 4 过夜包被要比37 2h效果好 但是区别不是很大 三种封闭液中5 脱脂乳的封闭效果最好 抗原最佳稀释度的测定 结论 抗原最佳稀释度为1 256 单抗工作浓度为1 800 二抗工作浓度为1 1000 单抗稀释液的选择 结论 两种稀释液的效果相近 差别不大 冲洗液的选择 12345 结论 以0 5MNaCl PBST 0 5 作为冲洗液灵敏性最强 PBS效果最差 用纯化的VP72S抗原包被板子在同一条件下对猪瘟病毒 猪繁殖呼吸综合症病毒 猪无名高热病毒 猪圆环病毒 细小病毒等病毒感染血清以及正常猪血清 抗非洲猪瘟病毒阳性鼠血清 和模拟发病猪血清进行特异性交叉试验 特异性交叉试验 灵敏性试验 结论 模拟血清稀释到1600倍仍可以检测到阳性 说明该方法具有较高的灵敏性 抗原包被板保存期的测定 20 放置抗原包被板OD值和P N的变化 4 放置抗原包被板OD值和P N的变化 结论 按此方法包被的酶标板在 20 至少放置60天 在4 至少放置7天 统计学t测验分析P 0 321 0 05差异不显著 统计学t测验分析P 0 190 0 05差异不显著 小结 获得5株抗ASF VP72阳性的杂交瘤细胞株腹水效价可达到216亚类鉴定为IgG2b建立了间接ELISA抗体检测方法4ug ml的融合蛋白GST VP72S作为包被抗原碳酸盐缓冲液为包被液 37 包被2h作为包被条件5