第二章 基因工程专题综合.ppt

一 基因工程 定义基因工程就是从生物体中把生物遗传物质分离出来 或人工合成一个DNA分子 用人工的方法对遗传物质进行搭配 组合 然后转入某细胞内 通过改变其遗传物质的结构 来改变它的遗传特性 使之定向地产生符合人类需要的新型生物物种 类型 一个基因一个性状 不一定 例如肤色的控制至少有三个基因参与 基因决定性状 环境还起不起作用 在基因型确定的基础上 环境常常会影响表型 人的肤色至少由三个基因控制 基因工程技术 基因工程是生物技术的核心部分 基因工程的操作可以简述如下 将外源基因 又称目的基因 是一段DNA片断 组合到载体DNA分子中去 再把它转到受体细胞 亦称寄主细胞 中去 使外源基因在寄主细胞中扩增和表达 从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质 基因工程的操作流程 获得目的基因 构造重组DNA分子 转化或转染 表达 蛋白质产物的分离纯化 基因工程的基本过程 第一例基因工程实验 PCR 聚合酶链式反应 分离 逆转录 基因工程步骤一 获得DNA片段 取得目的基因 1 从生物基因组中分离得到 基因组DNA 酶切产物 总RNA mRNA cDNA 2 人工合成 化学合成 PCR 把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步 PCR法 又称多聚酶链式反应 是近年来开发出来的基因工程新技术 它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增 放在一个步骤里完成 PCR操作流程 900C 500C 700C PCR反应分 第一步 900C高温下 使混合物的DNA片断因变性而成单链 第二步 500C温度下 引物DNA结合在适于配对的DNA片断上 第三步 700C温度下 由合成酶 DNA高温聚合酶 催化 从引物开始合成目的基因DNA PCR的三个步骤为一次循环 约需几分钟 每经一次循环 所找到的目的基因扩充一倍 经过20次循环 即可扩增106倍 首先要有载体其次需要各种工具酶 基因工程步骤二 DNA片段和载体DNA在体外连接构造重组DNA分子 在基因工程中的运用的载体包括 质粒载体噬菌体载体复合载体病毒载体 载体 是细菌 酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的双链闭合环状分子 大小为1 200Kb 能独立于染色体外进行自我复制 它的拷贝数较多 每个细胞中可含10 200个拷贝 其表型效应主要有决定抗药性 合成抗菌素 编码限制或修饰酶等 质粒载体 染色体 质粒 pBR322质粒图谱 是一种细菌病毒 可作为克隆载体 其优点是可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒 噬菌体载体 噬菌体 头部 尾部 尾丝 噬菌体感染细菌示意图 病毒载体这是一类真核载体 能把基因引入到真核细胞中 并在其中被表达 因此是研究真核细胞表达及调控的有力工具 如 腺病毒 乳头瘤病毒 疱疹病毒等 复合载体 工具酶要把目的基因 装 到载体中去 需要多种工具酶 其中关键的酶是限制性内切酶 此酶识别一定碱基序列 有的还可切出 粘性 末端 使得目的基因和载体的连接非常容易 是生物工程中最重要的工具酶 主要从原核生物中提取 它能识别双链DNA分子中的特异性核苷酸序列 使它在特定的位点水解 限制性内切酶 EcoRI识别序列 GAATTCCTTAAG 并切割如下 5 NNNNGAATTCNNN3 3 NNNNCTTAAGNNN5 限制性内切酶 PstI识别序列 CTGCAGGACGTC 并切割如下 5 NNNNCTGCAGNNN3 3 NNNNGACGTCNNN5 限制性内切酶 限制性内切酶识别特定的碱基序列 重组DNA分子的构建 限制性内切酶造成粘性末端 外源DNA 质粒 酶切位点 酶切位点 酶切 酶切 混合 DNA连接酶 质粒DNA 外源DNA 酶切 酶切 外切酶 外切酶 末端转移酶 末端转移酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 加热并慢慢变冷 用质粒构建重组DNA分子 1 转化某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA 而使其基因型和表型发生相应变化的现象 2 转染除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程 3 转导用噬菌体做载体 将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程 4 显微注射 基因工程步骤三 将重组的DNA分子引入合适的宿主细胞内 用噬菌体DNA构建重组DNA分子 从大量携带重组体DNA分子的宿主细胞中分离出携带目的基因的细胞 重组DNA分子进入寄主细胞后 其中的目的基因能否表达 表达效率高低 还有很大差别 表达通常是指目的基因编码蛋白质的合成 新基因能否在新细胞中定居下来 能否复制自己稳定传代 能不能产生表达作用 指导蛋白的合成 基因工程步骤四 表达筛选 1 遗传学方法对于带有抗药性基因的质粒 可通过检测受体菌是否由敏感状态变成抗药状态进行筛选 筛选方法 2 核酸杂交法 筛选方法 印迹法的主要步骤 1 基因文库 DNA用限制性内切酶处理 2 DNA片断混合物通过电泳分离 3 电泳后 通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上 以便操作 4 用已知小片断DNA作为探针 互补结合需要找的基因片断 5 探针DNA片断已用放射性元素标记 使胶片感光后可看出 印迹法的关键是 分子杂交 利用碱基配对的原则 用一段小的已知的DNA片断去寻找大的未知的基因片断 探针DNA片断来源根据目的蛋白的氨基酸序列 只要其中N 端15 20个氨基酸序列 按三联密码转为40 60核苷酸序列 人工合成 即为探针DNA片断 3 免疫学方法用特异性抗体检测基因产物从而筛选阳性克隆的方法 筛选方法 基因工程的最后一步 通常是把所获得的蛋白质分离纯化 得到蛋白质产品 基因工程步骤五 表达蛋白分离 生产基因工程产品 生物反应器 基因工程的应用 基因工程技术已经在医学 工业 农业等各个领域得到了广泛的应用 1 在医学上的应用基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质 肽类药物 转基因产品 微生物植物固氮基因 抗性基因 性状控制基因等 动物基因工程产品介绍 表皮细胞生长因子生长激素胰岛素疾病诊断 病毒检测遗传病检测 基因工程应用示例 胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素 干扰素1200升人血1升发酵液2 3万美元 病人200 300美元 病人 2 用于提高奶酪产量生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃 现在可以通过基因工程办法 用酵母生产凝乳酶 大量用于奶酪制造 哺乳小牛凝乳酶基因胃转入啤酒酵母凝乳酶凝乳酶制造奶酪 3 转基因动物和植物转基因动物首先在小鼠获得成功 现在转基因动物技术已用于牛 羊 使得从牛 羊