水稻组织石蜡制片技术.doc

水稻组织石蜡制片流程材料准备：10ml离心管（或5ml离心管）、胶头滴管、真空泵、切片机、染色缸、烘箱、烘片机，镊子。酒精、自来水、二甲苯、冰醋酸、甲醛、粘片剂（可用鸡蛋清/甘油=1/1，加防腐剂配成）、染色剂试剂配制：FAA固定液：70%乙醇：乙酸：甲醛=80:5:575%、85%、95%，无水乙醇染色缸内染液：视情况而定，可参考染色步骤。粘片剂：鸡蛋清/甘油=1：1，再根据量加入少许防腐剂（如苯甲酸钠、山梨酸钾或潮霉素等）处理顺序：离心管中加固定液，材料取好后放入固定液中。水稻叶片取下后如果不立即放入固定液中，叶片会卷起来。不要先取材料后加固定液。一、固定FAA固定液可过夜，真空泵抽气（至0.8-0.9间红线后再过十五分钟），过夜注意：固定液体积至少为材料体积的5至6倍。材料体积较小时，取2ml左右。石蜡制片不像其他分子实验那样力求精确。我的做法是将胶头滴管1ml位置沾上标签，每次吸溶液到标签附近即可，比用移液器省力许多。2、 脱水75%酒精可过夜 85%酒精 95%酒精 无水酒精 无水酒精每步处理各1h。3、 透明 （A：酒精 B：二甲苯 ）A/B=3/1 A/B=1/1可过夜 A/B=1/3 B B每步处理各1h。透明完成后，一般情况下，材料变成半透明玻璃色。4、 浸蜡 （B：二甲苯 C：石蜡）此步在70度烘箱中B/C=1/1可过夜 C1 C2 C3注意：B/C=1/1这一步尤其需要注意，因为比较幼嫩的组织遇到石蜡易皱缩，皱缩后的材料石蜡就很难透入了。解决的方法是让是让石蜡浓度缓慢升高。二甲苯中石蜡的浓度应该慢慢升高！通常的方法是向有材料的二甲苯溶液中慢慢加浮蜡。（材料与石蜡块均沉于二甲苯底部，当石蜡溶解时造成材料四周的短时局部石蜡浓度过高会造成材料皱缩变形。）浮蜡制法：将融化的石蜡在凝固过程中不停地快速搅动，使气泡进入蜡体内，最终凝成蜡块中容有大量小气泡，成为浮蜡。（搅到蜡快完全凝结时停下，不然就成一摊蜡屑了。）（石蜡比二甲苯密度大）因石蜡浮于二甲苯上部，不会与材料接触，所以材料不会皱缩变形。 B/C=1/1 C1详细的操作过程：（我的做法，仅供参考）B：此时材料在常温下通风橱中的离心管里。将离心管里的二甲苯倒出，加入4ml新二甲苯。向其中加入玉米粒大小浮蜡，溶解半小时左右后，浮蜡不再溶解。盖好盖子放入七十度烘箱。浮蜡溶解后，再加玉米粒大小浮蜡，待其溶解。直至浮蜡与二甲苯总共有8ml左右。此时B/C=1/1，可以过夜。将混合液体倒去4ml继续重复前法至8ml，此时石蜡占3/4了。假如是做的根的石蜡切片再弃去4ml，再重复一次。5ml离心管加液量减半。但5ml离心管做根的切片不太好。之后将镊子烧一下，将材料夹出放入盛有融化石蜡的蜡杯中。镊子烧一下因为热石蜡碰到冷镊子，会在镊子上凝结一层固体蜡，再去夹材料会使材料粘到镊子上。包埋时也要将镊子烧一下，原因相同。三个C的意思是三种不同熔点的石蜡，C1至C3熔点由低到高。但若实验室只有一种石蜡，可以是三份一样的石蜡，同时处理时间可短一点（但要保证二甲苯被完全置换出来）。如果这一步处理得好，处理出来的材料还是半透明玻璃状，形状也不会发生变形。常见的问题是材料缩水。石蜡融化后非常容易挥发，因此浸蜡过程中盛石蜡的烧杯上要罩封口膜。切记！5、 包埋（此步最好找人演示一下）融化的石蜡倒入蜡盒中 放入材料 蜡盒放入水中最终的效果是，材料和石蜡凝为一个方形蜡块。若做横切，则材料竖直放下去。若为纵切，则材料平躺着放下去。材料放入蜡盒这一步需要非常熟练。材料从C3至蜡盒这一步要尽量减少暴露在空气中的时间，以防材料表面的蜡凝结，不能与蜡盒里的蜡很好的融合。蜡盒是用信封纸叠的。可根据实验室里的模板比着折。折好后放在蜡里浸一浸以增加韧性。冬天或操作不熟练蜡盒做得短一些，一次只放一个材料。熟练工蜡盒可做得长一些，可同时容纳几个材料。镊子夹材料之前烧一下。具体步骤找人一演示就会，我也不太好说清楚。包埋步骤将材料夹入蜡盒操作需要练习一下。6、 制片修块：将含材料的蜡块修成四棱台形或长方体形。材料周围至少有2mm蜡。修块不熟练修出来很丑，不过对观察影响不大。粘块：修好的蜡块黏在小木块上。粘块相对简单。木块最好要提前在融化的石蜡里浸一段时间，这样蜡块与木块粘得更紧。切片：放在切片机上切片。切片厚度随意，一般五至十二微米。太薄了蜡带起皱，太厚了蜡带打卷，都不容易切好。粘片：将切出的蜡带放在显微镜下预先看一下，找出比较好的蜡片（待观察部分没有破洞）。将找出的蜡片放于涂有粘片剂的载玻片上。粘片剂涂法：手用肥皂洗去油污，将少许粘片剂滴于载玻片上，用手将粘片剂涂成非常薄而均匀的薄层。粘片剂的用量非常非常少（一滴粘片剂可涂二十几片载玻片，而且是将整个玻片涂满），而且总是从一个方向向另一个方向或者画圈，不能来回涂（来回涂会使厚薄不均匀）。粘片剂配方很多，我用的是蛋白粘片剂。蛋白：甘油=1:1，加入适量防腐剂。这种粘片剂的黏着力有点弱，而且易着色，不过基本可以满足实验要求。（假如天生做实验大条，换了其他黏着力强的粘片剂材料还是会掉下来的。要明白，粘片剂不是502）烘片（展片）：放于烘片机上烘片，温度为42度，一般两小时以内就好了。时间长点也没关系。不用烘片机也可以用酒精灯，玻片在火焰旁过一下，再放在手背上试试温度，玻片温度温热但不能烫手。7、 番红染色及制片 （A：酒精 B:二甲苯 D：清水 ）染色的方法有很多，比如苏木精、固绿等。现只介绍番红染色，操作上的相似之处很多。操作方法：将做好的载玻片从一个染色缸换到另一个染色缸。实验室有一种平头短镊子，夹玻片正好。立式染色缸加满要60ml左右，加30ml左右就好了。（载玻片加进去也要占体积）但要保证没过材料。立式染色缸两头各放一片载玻片，中间每隔背靠背可以放两片，每次最多放八片。脱蜡：B B 第一步时间三十分钟左右，第二步时间五分钟左右，必须脱净载玻片上的石蜡。但在常温下石蜡对二甲苯的溶解度仅有1:10左右，因此，二甲苯用几次之后脱蜡效果会很差，此时可适当延长浸蜡时间，或更换二甲苯。（GUS染色脱二甲苯及染色步骤跳过，直接拿去观察或封片，番红染色继续）脱二甲苯：A/B=1:1 A A 95%A 85%A 75%A 50%A 30%A D 每步30s至1min过染：番红染色液中1小时以上。必须要待到一小时以上，不到一小时染色剂渗透不进去。固绿染色时间很短。脱色：放回清水。脱一会儿色放显微镜下看一看，直至脱至满意的程度。我的番红染液是用水溶解的，所以要将酒精置换成水，还要在水中脱色。假如你是做的其他染色，步骤会有不同。制片： 脱水：30%A 50%A 75%A 85%A 95% A A A B B 滴一滴中性树胶盖上盖玻片，用镊子头轻轻敲出气泡，再放于常温下几天，等树胶干后即成永久切片。盖上盖玻片后可能会有小气泡，可以用橡皮赶出来。但要明白，关键还是操作时自己注意不产生气泡，而不是花大力气赶气泡。前七步每步十五秒，第八、九、十步一分钟，如果前一步脱蜡不干净，九、十步适当延长时间。脱色时每一步都看看，并灵活调整时间，防止颜色太淡。中性树胶只能与二甲苯互溶，因此需要用酒精置换水，再用二甲苯置换酒精。制片基本原理：以上基本流程可以保证做的时候不出问题。但石蜡制片的步骤繁琐，不同材料之间的操作流程稍有差异，因此希望您在做的时候能够提前明白每步操作的意义所在，灵活调整实验流程。石蜡制片技术的基本原理很简单，就是将植物组织中的水分替换成石蜡，使组织在常温下硬化并与固体石蜡牢固结合，这样的植物组织就容易用切片机切得很薄的。就像想把猪肉切成很薄的肉片，必须将其冷冻一样。但水与石蜡不能互溶，因此中间必须先让酒精置换水，再用二甲苯置换酒精，最后用石蜡置换二甲苯，使石蜡渗入组织之中。用到溶液的溶解性（+：可互溶 ：不可互溶）水酒精二甲苯石蜡水酒精二甲苯石蜡切出的蜡带贴到载玻片上，再根据相同的原理将石蜡替换成染色液，染色液再变回二甲苯（中性树胶只与二甲苯互溶）。在每步不同的溶液替换过程中，我们要建立一个浓度梯度，以使浓度缓缓地变化而不至于影响到将要观察的组织。可过夜的步骤不是一定要过夜。固定的时间要长一点，其它的步骤不过夜更好。石蜡切片时间很长，过夜步骤是让操作者有时间休息的。我一般是第一天取样、抽气固定，第二天做到石蜡/二甲苯=1/1，第三天做到包埋。包埋后的蜡块可以永久保存，找适当的时间切片、制片、观察。写了能过夜也不是可以丢在那里好几天不管。材料在酒精、二甲苯、高温石蜡中呆长了会变得很脆。仪器使用：leica石蜡切片机：左手手轮是粗调，右手手轮是微调和切片。有几个lock，是用完后锁住它不让它动的。还有几个地方是调刀片、材料位置的。不用电，简单易学。烘片机：是一台傻瓜仪器，摸索摸索很容易就能学会。真空泵：常规仪器。一般组织到最低气压下维持十五分钟。制片注意事项：1、 每一步置换结束的纯溶液处理那一步很重要。比如脱水的最后无水乙醇，透明最后的纯二甲苯，浸蜡最后的纯石蜡，滴中性树胶之前的纯二甲苯等步骤。否则切片时材料中会形成没有石蜡的空洞，这些地方切片时会被切碎。因此必须保证这些步骤的处理时间和处理溶液的纯度。2、 浸蜡那一步，浮蜡要一小块一小块的加入二甲苯中，以使蜡慢慢渗入到植物组织中。越幼嫩的组织在遇见蜡时越容易皱缩。3、 将组织用切片机切片是一项很需要经验的工作。在这一步如若处理不好，会碰上许多问题。（1）切出的切片容易卷成一卷，无法形成蜡带。解决方法：是蜡太硬导致。可以将蜡和木块取下，在酒精灯下轻轻烤一烤石蜡变软之后再切（只是轻轻烤一下，不要烤花掉）。或者将切片厚度调薄（但要注意处理与平行对照之间厚度一样）。（2） 切出来的蜡片非常皱，皱的材料都叠在一起。蜡片发皱一般不要紧，除非皱的材料重叠的很厉害。将蜡块在冰箱里冻一下，或者将切片厚度调厚。（3）切片中的材料周围都是小孔洞。形成原因是多方面的：1、将蜡块拿下来对光看一下，看蜡块以内有没有小气泡（圆形孔洞）或小的蜡的结晶（形状不规则，像小雪花）。小气泡一般是包埋操作不熟练或者蜡凝的太快所致。小结晶一般是蜡结的太慢所致。包埋时，把含有材料的蜡盒内，蜡的表面稍凝一层蜡皮时放入水盆降温最好。不要将蜡盒放在常温下、烘箱里或者冰水里降温。如为以上这种原因所致，多切几片，等过了小气泡后，窟窿会自动消失。2. 、切了很多片，有时材料直接与周围的蜡分离，甚至材料直接从蜡片中掉下来。这种情况最常见。主要原因是刀子太钝了。刀子应该从一头向另一头慢慢用，一般切几十片刀子就要移一下。3. 、蜡与组织的硬度差的太大。这在切老而硬的组织时尤为明显。可将修好的蜡块与木块放于-20冰箱里冻一会儿。但这种方法并不能完全避免小孔洞的产生。同时可以使用更高熔点的蜡。同时低温易使蜡块与木块脱离，因此粘蜡块与木块时要粘的紧一点。四 、材料变形了。比如根横切面是圆的，但切出来是奇形怪状的。脱水、透明、浸蜡不彻底都有可能。但可能性最大的还是浸蜡时出了问题。别忘了，材料遇蜡容易变形，因此蜡的浓度要慢慢升高。小建议：网上许多教学实验示范的石蜡切片操作比这个操作步骤简化许多，因为他们用到的材料都很硬。水稻组织比他们用的向日葵茎、水花生茎软得多，所以我建议如果没有十足的把握，操作不要简化。因为一时偷懒又得从头开始是很不值当的。下面谈一谈实验步骤简化的底线。75%酒精，85%酒精，95%酒精，处理时间可以改为半个小时。前提条件是处理的材料都很小，溶液渗透速度较快。水稻根、茎、叶都满足这一条件，因此就我们实验室的情况来讲，这一步可以做。烘箱的温度调高一些（75度），保证材料周围都是液态的石蜡，浸蜡时间可缩减到三小时。茎、节的处理渗蜡处理可以相对简化一下，但根的处理不可简化。假如本实验流程没能侥幸指导您做好切片，您可以参考李正理编写的植物组织制片技术，此人貌似很