脱落酸ABA.doc

植物生长激素检测试剂盒 ABACompetitive ELISA（请仔细阅读英文说明书，中文说明书仅供参考） 所有试剂及微孔板使用前均需回温到25左右1. 试剂盒内组分项 目96反应孔包被ABA抗体的微孔板1ABA追踪物3瓶-1ml冻干粉追踪稀释液（包含0.02%叠氮化钠）1瓶-15mlPNP底物片1瓶-6片X5mg底物稀释液（包含0.02%叠氮化钠）1瓶-30ml洗涤溶液（包含0.02%叠氮化钠）2瓶-30ml反应停止液1瓶-5ml说明书1封口膜2注意：以上物品需要在4环境下保存。 2. 原理利用酶联免疫的方法定量检测植物激素，ABA检测利用的是ABA单克隆抗体，这个反应在1ml中含有0.0064-0.16皮摩尔ABA比较敏感。这种测试方法用竞争性抗体结合方法来测定植物提取液中的ABA。ABA追踪物用碱性磷酸酶标记，当和植物提取液一同加入包被抗体的微孔板中，通过重氮甲烷预处理使酸转化为甲酯形式。一个竞争性的结合反应是建立在定量的追踪物和未知样品中IAA竞争有限数量的抗体结合位点的基础上的。 样品中的甲基化的ABA和追踪物竞争抗体结合位点，未结合的追踪物在加底物前被洗去，黄色的深浅和样品中的ABA含量成反比。3. 操作者应该注意之事项-反应停止液为1M NaOH，一种腐蚀性物质，如不慎接触到眼睛或皮肤，请用大量清水冲洗或寻求医生帮助。-ABA试剂盒仅为研究用，一些试剂中包含0.02的叠氮化钠做为防腐剂。-生长激素试剂盒-对温度敏感，应保存在4。-追踪物稀释的追踪物可以在4稳定保存7天。-底物底物溶液可在4稳定保存8小时。不要用过期的试剂。-只有在B0的OD值大于0.750结果才是可靠的，如果低于这个值，增加底物孵育的时间直到获得需要的OD值（不要超过30分钟）。4. 需要的材料但盒中不提供-酶标仪（405nm）-37孵育箱-(+) cis/trans ABA标准（Sigma Cat. No. A4906）-绝对的甲醇（稀释ABA标准）-TBS缓冲液（准备样品和标准）-容器（4个，用来装底物溶液，洗涤溶液，追踪溶液和反应停止液）-吸水纸-蒸馏水-微量移液器：1ml，5ml，100ul单道，50-200ul多道-在密封塑料盒底部铺一张吸水纸，倒入适量蒸馏水使之刚好润湿，即为恒湿箱，孵育用5. 实验过程样品准备对于不同类型的植物材料，样品的准备是多样的。结果可能会受到像萜类化合物、酚醛塑料、色素或其他的一些植物成分的影响。参考有关的文献来决定使用哪一种方法。最后的提取液有机溶剂在TBS缓冲液中不超过10%是很重要的。使用方法：1. 准备追踪溶液说明：每个小瓶中的追踪物可够32个反应用，标准和样品应该做2个重复，稀释的追踪物可在4稳定保存7天。-在冻干的追踪物中加1ml蒸馏水，等5分钟完全溶解。-在瓶中加入4ml追踪稀释液并充分混合。2. 准备标准称26.43mg 2-cis-(S)-ABA，并用10ml无水甲醇溶解，此时ABA的原始浓度为0.1umol/L，用琥珀（黄色）的小瓶在黑暗条件下保存于-20或更低。根据下面的图表，用TBS缓冲液按梯度稀释原始标准液。新的标准液只能在测试时准备好。原始浓度（SS）= 0.1molABA/ml = 100,000 pmol/ml, NSB=Nonspecific Binding（非特异性结合）, Bo=100%结合 Cup ABA 溶液 TBS 缓冲液 Pmol IAA/ml 稀释 A1=NSB 5 l of SS +4.99 ml 100 1:10 B1 500 l of A1 +2.00 ml 20 1:5 C1500 l of B1 +2.00 ml41:5 D1500 l of C1 +2.00 ml0.8 1:5 E1500 l of D1 +2.00 ml0.161:5 F1 500 l of E1 +2.00 ml0.0321:5 G1 500 l of F1 +2.00 ml0.00641:5 H1=B0 100 l of TBS 最适宜的敏感区域在0.0064-0.16pmolABA/ml3. 从锡纸袋中取出所需数量的微孔，将剩余的微孔密封放在冰箱中保存。4. 在微孔中加入100ul标准溶液或者样品提取液。样品或标准都应做2个重复。5. 在每个孔中用多道移液器加100ul第一步准备的稀释的追踪溶液。6. 轻轻的混匀，将微孔板放入恒湿箱中孵育或者封上封口膜孵育。7. 在冰箱中4孵育3小时。8. 在孵育结束前准备好底物溶液：用5ml底物稀释液溶解1片底物片剂。1片足够16个反应孔使用。9. 3小时孵育结束后，取出测试孔，将孔中溶液倒入水池中。10. 用多道移液器在每孔中加入200ul洗涤溶液来洗涤微孔，然后将孔中溶液倒入水池，重复2次以上。然后将微孔板倒放在滤纸上，控干里面的液体。11. 用多道移液器在每个微孔中加入200ul底物溶液。12. 将微孔板放入恒湿箱中中孵育或者封上封口膜孵育。13. 在37孵育60分钟。只有在B0的OD值大于0.750结果才是可靠的，如果低于这个值，增加底物孵育的时间直到获得需要的OD值（不要超过30分钟）。14. 取出微孔板在每个孔中加入50ul（1滴）反应停止液。等5分钟。15. 用酶标仪在405nm下读取吸光度值并纪录。计算1. 计算标准或样品的光密度值。2. 用下面的方法计算标准点或样品的结合百分比。% Binding = (Standard or Sample O.D. - NSB O.D.) x 100/(Bo O.D. - NSB O.D.)结合百分比 = (样品或标准的OD值 -非特异性结合的OD值) x 100/ (B0 的OD值 -非特异性结合的OD值) 说明: B = 标准或样品的OD值。NSB = 100 l of A (5000 pmol IAA/ml) + 100 l 追踪物 = 0%结合Bo= 100 l of H (追踪物 + TBS 缓冲液 = 100% 结合3.根据各个标准的浓度值（pmol /ml）得出对应的B/Bo值，做出4循环半对数曲线，即标准曲线（为S形曲线）4.从标准曲线上测出各样品的ABA含量5.标准曲线也可以用如下的公式计算对应值，做对数-对数曲线来转换：Logit (B/Bo) = Ln (B/Bo)/(100-(B/Bo)交叉反应Compound. Cross-Reactivity*2-cis-(S)-ABA 1002-cis-(S)-ABA methylester less than 0.12-cis-(R)-ABA 02-trans-(S)-ABA 02-cis-(S)-ABA-B-D-glucopyranosyl ester 02-cis-(S)-ABA-cis-diol 0Phaseic acid less than 0.1Dihydrophaseic acid less than 0.1Xanthoxin 0All-trans-Farnesol 0注意：如果试剂盒中的追踪物编号为lot 0045 或 0046，请将最后的孵育时间由60分钟改为30分钟。各溶液配置方法：反应停止液用800ml蒸馏水溶解以下物质：氢氧化钠 40g调整到1L，室温下保存。底物稀释液用800ml蒸馏水稀释以下物质：氯化镁 0.1 g 叠氮化钠0.2 g 乙醇胺97.0 ml 用盐酸调整pH值到9.8，用蒸馏水调整溶液体积到1L，4保存。TBS缓冲液/追踪稀释液用800ml蒸馏水稀释以下物质：Trizma base 3.03 g 氯化钠5.84 g MgCl2.6H2O0.20 g 叠氮化钠0.20 g 用盐酸调整pH值到7.5，用蒸馏水调整溶液体积到1L，4保存。洗涤溶液用1000m