蒽酮比色法测糖 .doc

蒽酮比色法测糖 一目的掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法 二原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。 本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。 三实验器材及试剂 马铃薯干粉、 可调试移液器或移液管 、可见分光光度计（723型）、电子分析天平 、水浴锅 、电炉子 蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。 标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。葡萄糖标准溶液：称取已在80烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200g的标准溶液。 蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84)稀释成1000ml而成。2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用。 四、操作 1可溶性糖的提取 称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水3040ml。将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度7080约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.20.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。 2显色及比色 吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。 3绘制标准曲线 准确称取0.1g葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻（约10min左右），在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白（此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致），进行比色。 既得标准曲线。 如下表格 编号123456体积ml012345浓度ug/ml0204060801002.样品含量的测定 样品液的制作： 精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中加入30ml沸水沸水浴30min（不时摇动）取出， 3000rpm离心10min（或过滤）反复洗涤残渣2次合并滤液冷却至室温定容到50ml的锥形瓶中再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中 样品液的测定： （1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却） （2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。 （3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。 3结果计算： CV w=100% m， 式中w：糖的质量分数（%） C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml） V：样品稀释后的体积（ml） m：样品的质量（ml）注意事项： 1.一定要注意温度要控制在100 2.从100开始