生物化学----蛋白质的性质实验.doc

生物化学实验讲义实验一 蛋白质的性质实验蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应实验目的1了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。4加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。，一、茚三酮反应1.实验原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，11 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。2.材料、仪器与试剂蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清水=19）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液3.实验操作取2支试管分别加入鸡蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。二、黄色反应1.实验原理含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液；大豆提取液(将大豆浸泡充分吸胀后，研磨成浆状用纱布过滤)；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液3.实验操作向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管 号1234567材 料（滴）鸡蛋清溶液4指甲少许头发少许0.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）244040444现象三、蛋白质沉淀反应蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。（一）蛋白质的盐析作用1.实验原理盐析现象是指般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐 析作用与两种因素有关： 蛋白质分子被浓盐脱水； 分子所带电荷被中和。蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清水=19）；固体硫酸铵；饱和硫酸铵溶（ 称取377 g硫酸铵溶于20500ml 的蒸馏水中。硫酸铵在20水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶）。3.实验操作取鸡蛋清溶液约 5ml 于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。将管内混合液过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。（二）重金属盐类沉淀蛋白质1.实验原理溶液 pH 在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如 Pb 2+ 、Cu 2+ 、Hg 2+ 及 Ag + 等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清水=19）；5CuS04 溶液；3AgNO3 溶液3.实验操作取试管 2 支各加蛋白质溶液 1ml，向各管分别滴加 2-3滴加 5CuS04 溶液、3AgNO3 溶液，观察各管所生成的沉淀。在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入 5CuS04 溶液，观察沉淀的溶解。（三）有机酸沉淀蛋白质1.实验原理生物碱是植物中具有显著生理作用的类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液 pH 值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成中性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清水=19）；10三氯醋酸溶液； 3.实验操作取蛋白质溶液 1ml 于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。思考题 1茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。2能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？3哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？实验二 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量【实验目的】 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。【实验试剂和器材】1.仪器 电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721型分光光度剂2.试剂 （1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100g/mL牛血清白蛋白溶液（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。（3）鸡蛋清1ml定容至50mL【实验步骤】1、标准曲线绘制取6支试管，按下表加入各试剂。 管号 试剂012345100g/mL牛血清白蛋白溶液mL00.20.40.60.81.0蒸馏水mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液mL5.05.05.05.05.05.0蛋白质含量/g020406080100加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品测定试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。【实验结果】根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g），按下式计算： 查得的蛋白质含量（g）提取液总体积（mL）样品蛋白质含量（g/g鲜重）= 样品鲜重（g）测定时取用的提取液体积（mL）【注意事项】（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验三 氨基酸的分离鉴定纸层析法【实验目的】通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。【实验原理】层析法又称色谱法。1903年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用表示分配系数。=一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。显然两个物质的分配系数差得越大，则越易分开。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90，再用另一个溶剂系统展层物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用Rf表示。Rf=每一物质的Rf值决定于该物质在两相间的分配系数（）和两相的体积比（AS/AL）。这两种相即是水（固定相）和有机溶剂（流动相）。 两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以R f值的主要决定因素是分配系数（）。对于某一物质在一条件下的值是固定的。因此R f值为其特征常数。现将影响R f值的因素概括如下：1、物质结构的影响：极性物质是易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此R f低于后者。CH2基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则CH2基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的R f值：甘氨酸丙氨酸亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸谷氨酸。极性基团的位置不同也会引起R f变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，-丙氨酸的R f值大于-丙氨酸。2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中R f值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当Rf值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的R f至少差别为0.05才能彼此分开。溶剂的极性大小也影响物质的Rf值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。3、pH的影响：溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式，例如氨基酸在酸性或碱性溶剂中变化如下：对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性中大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。溶剂的pH还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极性物质如（氨基酸）来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01molL1或0.4molL1HCl）洗涤滤纸除去之。5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过0.5。除上述因素影响Rf值外。样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。【实验器材及试剂】1器材：层析缸毛细管喷雾器培养皿层析滤纸2试剂：扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。【操作步骤】1将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2取层析滤纸（长1820厘米，宽14厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘23厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，作为点样位置，并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。3点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这五个位置上。电吹风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米。4扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米。待溶剂上升15厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5显色：用喷雾器均匀喷上0. 1%茚三酮丙酮溶液；然后置烘箱中烘烤5分钟（100）或用热风吹干即可显出各层析斑点。【结果与讨论】1计算出各种氨基酸的Rf值，并根据Rf值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。2对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。 实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量一、目的和要求了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率表现在三个方面：1、浓缩效应：样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前被浓缩成一样品薄层。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl、甘氨酸阴离子以及蛋白质，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl最初的迁移速度最快，这样在Cl后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。蛋白质由聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带，所以在浓缩胶中Cl是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。2、电荷效应：当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH = 8.9）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大，赶上了Cl，电位梯度消失，这时蛋白质在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。电荷多少决定泳动速度。3、凝胶的分子筛效应：由于蛋白质进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘和垂直板型之分，但两者的原理完全相同。三、操作步骤1. 将垂直平板电泳槽装好，不同的电泳槽安装的方法不同，按说明书进行。2. 分离胶的选择和配置方法 按照蛋白质不同的相对分子量选用不同浓度的分离胶。 蛋白质的相对分子量的范围分离胶的浓度10420%30%1104410415%20%4104110510%15%110551055%10%51052%5%（2）不同分离胶的配制方法分离胶的浓度20%15%12%10%7.5%重蒸水/ml1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml质量浓度为10%SDS/ml凝胶贮备液(Acr/Bis)/ml质量浓度为10%过硫酸铵/lTEMED/l总体积/ml0.752.50.16.6505102.352.50.15.0505103.352.50.14.0505104.052.50.13.3505104.852.50.12.5505103. 分离胶的灌制根据待测蛋白质样品的相对分子量选择合适的分离胶浓度，本实验选用小牛血清为待测相对分子质量的样品，用12%的分离胶。在15ml试管中依次加入重蒸水3.35ml、1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)缓冲液2.5ml10%SDS0.1ml、凝胶贮备液4.0 ml、 10%过硫酸铵50l和TEMED 5l，由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约3060min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净。4. 浓缩胶的配制和灌制一般采用5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水2.92 ml、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8）1.25ml、10%SDS0.05ml、凝胶贮备液（Acr/Bis）10%过硫酸铵25l、TENED5l，在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约30min）。5.样品的制备标准蛋白样品的制备 取出一管预先分装好的20l低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热35min，取出冷至室温。待测样品的制备 a.10l小牛血清加10l 2倍还原缓冲液。b.10l小牛血清加10l 2倍非还原缓冲液。以上a、b两管均同标准蛋白质样品一样，在沸水浴中加热35min，取出冷至室温。6. 电泳待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液。 用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。 接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至2030mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。 7 染色与脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中，加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色掖，直至背景清晰。四、试剂和器材试剂1.凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水至100ml.外包锡纸，4冰箱保存，30天以内使用。 2.分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。 18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml重蒸水，用1mol/LHCl调pH到8.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4冰箱保存。3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。6gTris,加约60ml重蒸水，用1mol/LHCl调pH至6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4冰箱保存。4. 10%SDS，室温保存。5. 两类样品缓冲液：（1）2倍还原缓冲液（2reducing buffer）。0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml甘油2.0 ml质量浓度10%SDS4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml-巯基乙醇1.0 ml总体积10 ml2倍非还原缓冲液（2non-reducing buffer）。 重蒸水1.0 ml0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml甘油2.0 ml质量浓度10%SDS4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml总体积10 ml6. 电极缓冲液，pH8.3。Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水1000ml，4冰箱保存。7.低相对分子质量标准蛋白质（上海产），开封后溶于200l重蒸水，加200l2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，-20保存。临用前沸水浴35min。8.质量浓度为10%过硫酸铵：此溶液需临用前配制。9. 染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸。10. 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。11.待测相对分子质量的样品。器材1.直流稳压电泳仪。2.垂直平板电泳槽。3.移液器（1.0ml、200l、20l）。4. 微量注射器（20l）。3.烧杯、试管、滴管。五、思考题1. 样品溶液中各种试剂的作用是什么?2. 本实验是否需在低温下进行?3. 电泳过程中正负极发生什么变化 ? 4. 影响实验误差可能的原因是什么?根据你的实验进行分析。实验五 糖的性质实验及总糖和还原糖含量测定一. 实验目的1.加深对单糖、二糖、多糖化学性质的认识，进一步体会糖类化合物的分子结构与其化学性质的关系。2.了解3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的基本原理。3.区分还原糖和总糖测定过程的异同，掌握具体的操作方法。二. 实验原理糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。单糖及分子中含有半缩醛（酮）羟基的二糖都具有还原性，能将班氏试剂还原成砖红色的Cu2O 沉淀。蔗糖等不含有半缩醛（酮）羟基的糖则无还原性。但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖，因而水解液具有还原性。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，无还原性。但多糖在酸存在下加热水解，可生成单糖，随之具有还原性。淀粉为一多糖，经水解先生成糊精，再水解成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖，因此水解液也具有还原性，能与班氏试剂发生反应。淀粉遇碘显蓝色，此反应很灵敏，常用于检验淀粉或碘。糖在浓酸存在下，可与酚类化合物产生颜色反应。糖在浓硫酸的作用下与-萘酚反应显紫色，常用于糖类化合物的检出。己酮糖与间-苯二酚-盐酸试剂反应很快出现鲜红色，而己醛糖显色缓慢，两分钟后可出现微弱的红色，因此常用于区别酮糖（果糖）和醛糖（葡萄糖）。还原糖是指含有自由醛基或酮基、具有还原性的糖类。单糖都是还原糖。3，5二硝基水杨酸与还原糖共热后可生成棕红色氨基化合物，在一定范围内，该棕红色化合物颜色的深浅与还原糖的量呈正比关系，可用分光光度计进行比色测定。因此3，5二硝基水杨酸法可用于还原糖的测定，且具有快速、杂质干扰小的优点。不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的总糖含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-= 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。三试剂（1） 班氏试剂的配制：称取柠檬酸钠20g，无水碳酸钠11.5g，溶于100ml 热水中，在不断搅拌下把含2g硫酸铜晶体的20ml 水溶液慢慢加入。溶液应澄清，否则需过滤。（2）2%葡萄糖（3）2%果糖（4）2%麦芽糖（5）2%蔗糖（所用蔗糖必须纯净）（6）2%淀粉溶液：将2g可溶性淀粉用10ml 蒸馏水调成糊状，加入90ml 沸水中煮沸后冷却。（7）3molL1H2SO4溶液（8）10%Na2CO3 溶液（9）0.1%碘液：在1g碘和5g碘化钾中，加入尽可能少的蒸馏水使其溶解，然后用蒸馏水稀释为1000ml。（10）浓盐酸（11）-萘酚试剂的配制：将10g-萘酚溶于95%乙醇中，再用同样的乙醇稀释至100ml，贮于棕色瓶中，一般用前才配制。（12）浓硫酸（13）间-苯二酚-盐酸试剂的配制：将0.05g 间-苯二酚溶于50ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100ml。（14）3，5二硝基水杨酸试剂(DNS)：6.3gDNS 和262mL2mol/LnaOH 加入到500mL 含有182g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5g 重蒸酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中，710天后使用。（15）葡萄糖标准溶液(1000g/mL)：准确称取干燥恒重的葡萄糖1g，加入少量水溶解后再加入8mL12mol/L 的浓盐酸，以蒸馏水定容至1000mL。（16） 6mol/L 盐酸:取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。（17）10%NaOH（18）6mol/LNaOH：取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。（19）碘试剂：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。（20）酚酞试剂:称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。四实验方法和步骤（一） 糖的还原性：取5 支大试管，编号后各加入1ml 班氏试剂，再分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%麦芽糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液各10滴。振荡后，将试管用橡皮筋捆好放入沸水浴中，加热35分钟，观察那几个试管中生成砖红色沉淀。（二）蔗糖的水解：取2 支大试管，各加入2%蔗糖溶液1ml，然后于一支试管中加入3molL1H2SO42 滴，将此支试管置于沸水浴中加热510 分钟，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止。将两支试管各加入班氏试剂1ml，再在沸水浴中加热35分钟，观察并比较两管的结果。（三） 淀粉与碘的作用：取1 支大试管加10 滴2%淀粉溶液和1滴0.1%碘液，观察呈现的颜色。然后将此试管放入沸水浴中加热510 分钟，观察有何现象。取出试管，放置冷却，又有何变化，为什么？（四）淀粉的水解：取1支大试管，加2%淀粉溶液2ml ,再加入浓盐酸3 滴，在沸水浴中加热1015分钟，加热时每隔12 分钟取出1滴反应液，置于白瓷滴板上，加1滴碘液，注意观察其颜色的变化过程，直到无蓝色出现为止。取出试管，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止，加入班氏试剂510滴，然后在沸水浴中加热35 分钟，观察结果。（五）糖的颜色反应 -萘酚反应：取4 支小试管，分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液1ml，然后各加入新配制的-萘酚试剂2 滴，混合均匀后，将试管倾斜沿管壁徐徐注入浓硫酸各1ml,切勿摇动。然后竖起试管，静置10 分钟，观察两液界面之间出现紫色环。如无紫色环生成，可在水浴中温热后再进行观察。 间-苯二酚反应：取4 支大试管，分别加入间-苯二酚-盐酸试剂1ml，然后在三支试管中各加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖溶液5滴，第4 支试管留作对照。将4 支试管摇匀后，同时放入水浴中加热2 分钟，观察各管出现颜色的顺序。（七）样品中总糖和还原糖的测定1.还原糖的制备准确称取 1g玉米粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约4ml)调成糊状，然后加入80ml蒸馏水，混匀，于50 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。2样品总糖的水解及提取准确称取1g玉米粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 20ml，蒸馏水30ml，在沸水浴中加热0.5h，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤，取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。3葡萄糖标准曲线的制作及样品测定（1）标准葡萄糖梯度溶液的配制：取8支大试管，分别按下表加入试剂。管号操作空白标准葡萄糖浓度梯度样品012345葡萄糖标准液(mL)0.20.40.60.81.0样品待测液(mL)1.01.0蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.01.01.0DNS试剂(mL)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟比色以0号管为空白参比，测定l=540nm处的吸光度记录吸光度（A540）（2）绘制标准曲线由05号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)；按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：还原糖(%)=糖量(mg)样品稀释倍数100/样品量(mg)总糖（%)=糖量(mg)样品稀释倍数100/样品量(mg) 0.9思考题1.糖都包括哪些化合物？2.为保证样品中糖测定的准确性.，应注意哪些操作事项？3.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？实验六 碱性磷酸酶的分离纯化，比活性测定及动力学性质分析一. 实验目的 1掌握碱性磷酸酶分离纯化的实验方法。 2掌握酶活性测定的一般实验方法。(一)碱性磷酸酶的分离提纯实验原理 本实验采取有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)，利用乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以降低酶的溶解度，使酶蛋白沉淀析出。在制备肝匀浆时采用低浓度醋酸钠，可以达到低渗破膜的作用，而醋酸镁则有保护和稳定 AKP的作用。匀浆液中加入正丁醇能使部分杂蛋白变性，再通过过滤，可以除去变性杂蛋白。含有AKP的滤液可再进步用冷丙酮和冷乙醇进行分离纯化。根据AKP在终浓度33的丙酮或终浓度30的乙醇中是溶解的，而在终浓度50的丙酮或终浓度60的乙醇中是不溶解的性质，采用离心的方法分离提取，可使AKP得到部分纯化；试剂及器材 试剂10.5M醋酸镁溶液(分子量214.45)称取醋酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。 20.1M醋酸钠溶液(分子量82.03)称取醋酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。30.01M醋酸镁-0.01M醋酸钠溶液：量取0.5M醋酸镁20ml，0.1M醋酸钠100ml，混合后加蒸馏水稀释至1000ml。 4丙酮(分析纯)595乙醇(分析纯)6Tris缓冲液(pH8.8) 称取Trisl2.1g，用蒸馏水溶解成1000ml，为0.1MTris液，取0.1MTris液100ml，加 0.5M醋酸镁20ml，和蒸馏水800ml，再用1醋酸调节pH至8.8，然后用蒸馏水稀释至 1000ml。7复合基质液： 称取磷酸苯二钠2H20 6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中。两液混合并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一星期。临用时将此液与等量0.1MpHl0碳酸盐缓冲液混合即可。8酚标准液(0.1mgm1) 称取结晶酚1.50g溶于0.1N盐酸至1000ml，为储备。 称取0.8581g重铬酸钾，用蒸馏水溶解，并稀释至250ml浓度即为0.07N，做基准物。 称取12.5g硫代硫酸钠5H20，用煮沸后冷却的蒸馏水配成500ml，加约0.2g碳酸钠，保存于棕色试瓶中，放暗处，一周后进行过滤，标定，其浓度大约为0.1N。 称取6.5g碘和10g碘化钾，混合后用少量蒸馏水溶解。再用蒸馏水稀释至500ml，保存于棕色试剂瓶，置暗处以待标定，其浓度约为0.1N。 采用间接碘量法，以重络酸钾为基准物标定硫代硫酸钠溶液；再用标定过的硫代硫酸钠标定碘溶液。 标准酚溶液的标定 取25ml上述酚溶液，加50m10.1N NaOH，在沸水溶中加热至65，再加入上述碘液 25ml，盖好放置30min后，加浓盐酸5ml，再加0.1淀粉溶液lml为指示剂，用上述硫代硫酸钠滴定。3分子碘与1分子酚起作用，按此比例计算出每毫升酚溶液所含的酚量。应用时按上述结果用蒸馏水将酚溶液稀释至0.1mgml。90.1M碳酸盐缓冲液pHl0(37时) 称取无水碳酸钠3.18g及碳酸氢钠1.68g溶解于蒸馏水中，稀释至500m1。10碱性溶液：量取0.5molLNaOH溶液与0.5molLNaHC03溶液各20m1，混合后加蒸馏水至100ml。110.5铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾5g和硼酸15g，各溶于400ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000ml，置棕色瓶中暗处保存。 12试剂甲、试剂乙的配制法见实验二(Lowry法测定蛋白质含量)器材 1 。721分光光度计 2台式离心机 3恒温水浴箱 4匀浆器四实验方法和步骤 丙酮浓度计算：与上相仿。 注意： 1各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。 2有机溶剂应预先冷却到-l015左右。 3加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。 4加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。 5采用短时间的离心以析出沉淀，而且最好立即将沉淀溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。 6凡弃去上清液中含有丙酮及乙醇者均需倒入回收瓶中回收。(二)碱性磷酸酶的比活性测定实验原理 比活性是指单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。因此，随着酶被逐步纯化，其比活性也随之逐步升高，所以测定酶的比活性可以鉴定酶的纯化程度。 根据国际酶学委员会的规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。因此测定样品的比活性必须测定：(1)每毫升样品中的蛋白质毫克数。(2)每毫升样品中的酶活性单位数。其中碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠法测定，即以磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后产生游离酚和磷酸盐，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物，根据红色的深浅就可测定酚的含量，从而计算出酶的活性大小。 反应如下： 酶活性单位表示：在37下保温15分钟产生1g酚者为1个酶活性单位。样品中的蛋白质含量用Lowry法测定(见实验二)。实验方法和步骤1 样品中碱性磷酸酶活性测定： (1)取试管5支，编号，按下表操作： 混匀，37水浴中准确保温15分钟。 保温结束后，各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应，再加入0.5铁氰化钾2.0毫升，立即混匀，静置10分钟，在5l0nm波长下比色。 (2)酶活性单位计算 附注； a从上述操作过程中可知A管、B，管稀释50倍，C管稀释5倍。 b酶活性单位数，也可通过标准曲线求得： 标准曲线制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液(1ml=0.1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37水浴保温5分钟，各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。 2样品中蛋白质含量的测定：(1) 测定蛋白质时，保留的A，管还需稀释5倍为A”管，否则蛋白质浓度太高，其余各管不需再稀释，各用1.0ml进行测定。 立即振摇均匀，在20-25保温30分钟后，于660nm波长比色。 (3)蛋白质浓度计算： 从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中蛋白质毫克数。 注：从上述操作过程中可知A”管稀释250倍，B，管稀释50倍，C管未稀释。 3比活性的计算 碱性磷酸酶比活性每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数每毫升样品中蛋白质毫克数 4实验结果： 将上述各实验计算结果填入下列表内 碱性磷酸酶的动力学分析(一)进程曲线的制作和初速度的测定实验原理 要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。要求出代表酶反应初速度的时间范围就必须制作酶反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明 酶反应随反应时间变化的情况。本实验的进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法，以酶反应时间为横座标，产物生成量为纵座标绘制而成的。从进程曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。但是，随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应速度随反应时间的延长而降低这现象可能是由于反应时间延长以后底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所引起的。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶反应时间成正比的这一段时间内进行初速度的测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。制作进程曲线，求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。实验方法和步骤 (1) 取12支试管按下表操作 (2)以0号管调零，测出A510后，以反应时间为横座标，A510为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出碱性磷酸酶反应初速度的时间范围。 (二)米氏常数的测定实验原理 米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km的方法。 在酶促反应中，当反应体系的温度、 pH及酶浓度恒定时，反应初速度V随底物浓度S的增加而增加，最