β-防御素.doc

-防御素自然界存在着无数的微生物,它们时时刻刻都在威胁着其他物种的生命。多细胞生物为了抵御各种有害微生物的入侵,逐渐进化发展并形成一套完整有效的免疫防御机制。其中一种就是近年来已引起广泛研究兴趣的阳离子抗菌肽防御素。1991年首次在牛体内发现-防御素-2这一阳离子多肽抗生素,命名为TAP ( TrachealAntmi icrobialPep-tide),后来在牛的粒性白细胞中又发现了13种与TAP序列高度同源,但与-防御素不同的防御素,于是命名为-防御素1,之后的10多年,有多种-防御素被分离和鉴定,已阐明-防御素具有多种抗菌、抗真菌、抗病毒活性,并且带电荷氨基酸和特殊氨基酸的改变会导致抗菌谱的变化2。-防御素主要分布于呼吸道、胃肠道、生殖道表面和腺体中,形成抵抗病原体的第一道重要防线。1-防御素的分子结构成熟的-防御素一般由3842个氨基酸组成,前体分子由6468个氨基酸残基组成,信号序列和前导序列是2232个氨基酸残基。在整个氨基酸序列中只有2种氨基酸残基(共8个氨基酸)被高度保存,第一种是位于N末端的甘氨酸(2个)。第二种是半胱氨酸(6个),保守的6个半胱氨酸残基形成3个二硫键稳定结构,连接方式为Cys-2与Cys-4,Cys-1与Cys-5和Cys-3与Cys-6相配对连接3-4,形成了3股反向平行的-片层结构。二硫键和-片层结构可以使小分子防御素紧密联结以防御蛋白酶水解,所以在富含蛋白的吞噬溶酶体环境中仍能保持其特性。这也是防御素区别于其他抗微生物肽的主要因素5-6。2-防御素的生物学活性2.1 抗菌活性每种-防御素在体内都表现广谱的抗细菌或真菌的能力。体外试验表明,HBD-2对大肠杆菌的LD50为0.46 nmol/m;lHBD-2杀绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC62 g/m,l而杀大肠杆菌的MIC15 g/ml7-8。禽-防御素中Sphe-2的抗菌谱不仅包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,还对烟曲霉菌有抵抗作用,进一步研究表明合成的Sphe-2在低pH值条件下仍具有抗菌活性,这对企鹅在孵蛋期保存其胃内食物具有重要意义9。大多数研究表明,-防御素在较高的抗菌活性阳离子浓度(如氯化钠)下将丧失抗菌活性。抗菌活性的丧失主要取决于电荷离子。一项关于HBD-2的研究表明,二价的阳离子(如Ca2+、Mg2+)相对于一价阳离子(Na+、K+)具有较高的抑制其抗菌活性的能力2,5,10。2.2抗病毒活性人-防御素(1-3)已被证实对病毒具有杀伤作用,这些防御素对单疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒(HIV)等衣壳病毒有明显的杀伤力。体内试验显示,-防御素可延缓或根除兔梅毒,可使牙周炎龈下菌群恢复正常。已证明-防御素对病毒的杀灭作用依赖于其分子内二硫键的紧密程度、-防御素的浓度等因素,还与pH值、温度等因素有关11。2.3细胞毒作用在体外试验研究中,观察纯化的-防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的作用情况,发现-防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞具有毒性作用,并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。需要指出的是,-防御素的细胞毒活性是非肿瘤细胞特异的,它不仅对肿瘤细胞具有毒性作用,而且对自身细胞也有一定侵害作用12。但是进一步研究表明-防御素对宿主细胞的毒性是由于-防御素较高的正电荷和高度的疏水性导致的,但是具有较高的正电荷和低度的疏水性的-防御素只有抗菌作用却不表现细胞毒作用13。2.4其他生物学活性-防御素不仅作为抵御微生物入侵的首道屏障发挥重要作用,而且也是机体免疫反应的重要组成部分。如-防御素(1-3)有多种免疫活性,可以诱导Mast细胞释放组胺,是单核细胞、树突状细胞、多形核中性粒细胞和T细胞的化学诱导剂,并且可以促进TNF和IL-1的产生8。也有研究表明-防御素能够激活人的补体系统11。其中-防御素-3能够通过下调截短性BId(一种促凋亡蛋白)、上调BcL-xL(一种抗凋亡蛋白),作用于细胞表面的CCR6,抑制中性粒细胞的凋亡14。此外,研究表明-防御素-2还可以显著地趋化未成熟的树突状细胞和T细胞以及7种不同基因编码的相关蛋白,进而直接或间接地参与到先天性免疫中来15。-防御素还可以通过调节细胞因子降低机体的炎症反应。近期研究发现,HBD-3与rHagB(红血球凝集素B)结合后,可以显著减轻IL-6、IL-10、GM-CSF和TNF-a所诱导的炎症反应,同时还可以降低一半的酶活性16。3-防御素的作用机理3.1抗菌机理大多数的HBD-2和HBD-3拥有两性分子的活性,研究认为,这些两性分子有助于缩氨酸分子在细菌膜表面的堆积,进而形成跨膜的“虫洞”10。曾雄等发现人的抗菌肽-防御素-3能够抑制细菌细胞壁的形成17。以上均导致细菌胞壁的穿孔,进而扰乱了细胞的通透性和细胞的能量状态,导致细胞膜去极化,呼吸作用受到抑制,细胞内物质的外泄及外界物质的渗入,这些最终引起菌体的死亡。3.2抗病毒机理防御素对病毒的抑制作用是直接的,对病毒的抑制程度依赖于防御素的浓度、分子内二硫键的紧密程度。防御素的抗病毒功效同样受时间、pH值、温度等因素的影响。同时,在试验体系中加入血清或血清蛋白时也可以大大减弱防御素的抗病毒作用18。4-防御素基因工程制备因-防御素具有抗菌等多种生物活性,不易诱导产生耐药菌株的独特机理以及其他的生物学活性,而具有广阔的应用前景。但-防御素在机体组织中表达极少,因此通过基因组学制备构造更为简单、生物活性更强、无溶血等毒性的-防御素突变体成为近期研究热点。4.1原核微生物表达原核表达具有操作方便、快捷、需时较短、表达量大、适合工业化生产等优点,所以原核系统仍是合成外源蛋白的首选。2001年Harder等在原核细胞中均采用了融合表达的方式,把HBD-3与His-Tag连接,导入大肠杆菌中表达,经肠激酶消化, HPLC纯化,得到了具有天然活性的防御素19。2008年王海英等成功构建了pGEM-c2x-Gal-2融合表达载体,转化大肠杆菌DH5宿主菌,诱导后,获得了以包涵体形式存在的融合蛋白,经凝血酶处理释放出鸡防御素-2,但是并没有关于其活性的报道20。然而,原核表达对于翻译的蛋白质加工和修饰作用较差,虽然融合表达在一定程度上能够避免防御素对宿主的细胞毒作用,但所表达目标蛋白的生物学活性往往较低21-22,要想真正运用于工业化大生产还有很多地方需要完善。4.2真核微生物表达真核基因表达调控是一个复杂的过程,转录因子可以形成复合物和调控元件相互作用,它们的构象变化和基团修饰等都在调控过程中起作用。石卓等用重组质粒pShuttle-CMV-rBD2转化大肠杆菌(E.coli)BJ5183AD-1后,与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1发生同源重组,转录到293细胞中进行包装,之后感染cos-7细胞,收获大量的具有抗菌活性的-防御素-223。李娟等通过重组真核表达载体pCAGG-hBD2,转染小鼠纤维母细胞(L929),结果显示金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有明显的杀灭效应24。曹玉红等通过重组真核表达载体pcDNA3. 1(+)/HBD,亦收到了具有生物学活性的蛋白25。酵母是目前研究比较成熟的一种表达系统。自从Mar-ciu等利用毕赤酵母成功表达具有生物学活性的抗生素后26,近年来,已有数种人、牛、昆虫等的防御素在酵母系统中成功表达。研究表明,-防御素在其他酵母菌(如酿酒酵母)中的表达水平较低,选用毕赤巴斯德酵母获得了高效表达,表达量高达70mg/L,并且重组肽具有和天然肽相似的二级结构和生物活性27。5-防御素研究中存在的问题及研究展望5.1存在问题对-防御素的抗菌机理仍然只是停留在推测阶段,具体的杀灭病原体的机理尚不明确。自2005年Enno等研究发现-防御素对宿主细胞毒作用是由高电荷及高度的疏水性而致,而高电荷和低疏水性的-防御素不表现对宿主细胞的毒作用,使得大量生产具有高度抗菌活性而对宿主细胞无毒害作用的防御素成为可能5。但是如何生产出大量高抗菌活性、低细胞毒作用的防御素并广泛运用于生产生活仍有很多工作要做。5.2药用前景-防御素因其广谱的抗菌活性,独特的抗菌机理,不受传统抗生素耐药菌株影响,并与典型的抗生素具有协同作用,中和内毒素,调节机体免疫应答和炎症反应,调节组织创伤修复等优点引起了人们的日益关注28。同时,研究表明,附睾-防御素可以结合在精子表面,保护精子在男性和女性生殖道内免受细菌或病毒的攻击,从而促进精卵作用。Binlb是一种具有人类基因同源性的大鼠附睾特异性-防御素,能在附睾的不同区域以不同结合方式结合于精子头部,其可通过激活精子L型Ca2+通道,进而促使未成熟精子获得运动能力,可以利用Binlb作为男性不育诊断的一个指标,将使男性不育治疗获得突破性进展;同时也可以将其作为男性避孕药物筛选的作用靶点,使其在男性避孕药物开发中展示广阔的前景。5.3 用于饲料添加剂抗菌肽作为饲料添加剂对细菌有抑