各种显微镜的讲义.doc

几种特殊的光学显微镜（一）暗视野显微镜 暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨 0.004m 以上的微粒的存在和运动。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。暗视野显微镜的基本使用方法如下：1安装暗视野聚光器（或用厚实的黑纸片制成遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野效果）。2选用强光源，一般用显微镜灯照明，以防止直射光线进入物镜。3在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。4进行中心调节，即水平移动聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。升降聚光器，将聚光镜的焦点（图 2 中圆锥光束的顶点）对准待检物。5选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，按普通显微镜的方法操作。（二）体视显微镜体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间影像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为 110 mm）以及连续放大观看等特点。生物学上常用于解剖过程中的实时观察（附图 13）。普通光学显微镜的光源为平行光，因而形成的是二维平面影像；而体视显微镜采用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束具有一定的夹角体视角（一般为 12o15o），因而能形成三维空间的立体图像。体视显微镜与普通光学显微镜的使用方法相近，但更为便捷。二者的主要区别在于：1. 体视显微镜的镜检对象可不必制作成装片。2. 体视显微镜载物台直接固定在镜座上，并配有黑白双面板或玻璃板，操作者可根据镜检的对象和要求加以选择。3. 体视显微镜的成像是正立的，便于解剖操作。4. 体视显微镜的物镜仅一只，其放大倍数可通过旋转调节螺旋连续调节。（三） 荧光显微镜荧光显微镜是利用细胞内物质发射的荧光强度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。细胞内的荧光物质物质有两类，一类直接经紫外线照射后即可发荧光，如叶绿素等；另有一些物质本身不具这一性质，但如果以特定的荧光染料或荧光抗体染色，经紫外线照射后亦可发荧光。荧光显微镜的原理为利用一个高发光效率的点光源（如超高压汞灯），经 过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650 或紫蓝光4200)作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各色的荧光后，再通过物镜后面的阻断(或压制)滤光片的过滤，最后经由目镜的放大作用加以观察。阻断滤光片的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜以免干扰荧光和损伤眼睛；二是选择并让特定的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。荧光显微镜按照光路原理可分为两种：1透射式荧光显微镜 较为旧式的荧光显微镜，其激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以它仅适用于观察较大的标本材料。2落射式荧光显微镜 激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(附图 1-5)。光路中需加上一个双色束分离器（分色镜），它与光轴呈 45o 角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片双色束分离器阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。（四）相差显微镜相差显微镜是能将光通过物体时产生的相位差（或光程差）转变为振幅（光强度）变化的显微镜。主要用于观察活细胞、不染色的组织切片或缺少反差的染色标本。人眼只能鉴别可见光的波长（颜色）和振幅的变化，不能鉴别相位的变化。而大多数生物标本高度透明，光波通过后振幅基本不变，仅存在相位的变化。相差显微镜基本把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4（波长），如果再增加或减少 1/4，则光程差变为 1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差（见图 6）。从结构上看，相差显微镜与普通光学显微镜不同之处在于：1环形光阑具有环形开孔的光阑，安装在光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。2相位板相差显微镜在物镜内部增加了涂有氟化镁的相位板，作用是将直射光或衍射光的相位推迟 1/4。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。相位板按工作效果分为两种类型：（1）A+相板：将直射光推迟 1/4，两组光波合轴后光波叠加，振幅加大，标本结构比周围介质更加明亮，形成亮反差（或称负反差）。（2）B+相板：将衍射光推迟 1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，标本结构比周围介质更加暗淡，形成暗反差（或称正反差）。带有相板的物镜叫相差物镜，常在物镜外壳上标以“Ph”字样。3合轴调节望远镜相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在外壳上标有“CT”符号），用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合，以便实现对直射光和衍射光的特殊处理。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，调节合轴调节望远镜的焦点，视野中会呈现两个圆环，分别是明亮的环状光阑圆环与较暗的相板上共轭面圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节螺旋，使两环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后即可取下合轴调节望远镜，换回目镜。4绿色滤光片 用于调整光源的波长。照明光线的波长不同，会引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整。相差显微镜的使用步骤如下： 根据待检标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。 将标本玻片放到载物台上，进行光轴中心的调整。 使用合轴调节望远镜，调 整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合后，换回目镜。在观察过程中，每次更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。 加绿色滤光片，按普通光学显微镜的操作步骤进行观察。（一）透射式电子显微镜透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）的组件包括：1. 电子枪 发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。2. 聚光透镜 即电子透镜，将电子束聚集，可用于控制照明强度和孔径角。3. 样品室 放置待观察的样品，并装有旋转台，用以改变试样的角度，还有装配加热、冷却等设备。4. 物镜 为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。物镜是决定透射电子显微镜分辨能力和成像质量的关键。5. 中间镜 为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流，可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。6. 透射镜 为高倍的强透镜，用将二次放大后的中间像进一步放大后在荧光屏上成像。7. 二级真空泵 对样品室抽真空。8照相装置 用以记录影像。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为 50100 nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。通常用薄切片法或冷冻蚀刻法制备：（1）薄切片法 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度 2050 nm，采用重金属盐染色，以增大反差。（2）冷冻蚀刻法 亦称冰冻断裂法。将标本置于100?C 的干冰或196?C 的液氮中冰冻后，以冷刀急速断开标本。断裂的标本升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。蚀刻完成后，向断面以 45o 角喷涂一层蒸气铂，再以90o 角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，剥下碳和铂的膜，称为复膜，能显示标本蚀刻面的形态。在电镜下观察得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。（二）扫描式电子显微镜 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于 20 世纪 60 年代问世，目前分辨力可达 610 nm。其工作原理是由电子枪发射的精细聚焦电子束经两级聚光镜、偏转线圈和物镜射到样品上，扫描样品表面并激发