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LightCycler 480仪器实时PCR检测格式LightCycler 480仪器使用荧光染料在线、实时监测循环扩增阶段PCR产物的产生以及利用荧光染料在PCR后熔解曲线分析中分析PCR产物熔解。循环扩增阶段测量的荧光信号与PCR产物量相关，从而可以计算靶核酸的复制数量（可利用序列非依赖检测格式和序列特异性格式）。PCR后熔解曲线分析阶段，荧光测量可用于PCR产物鉴定（序列非依赖检测格式）和基因分型（序列特异性格式）。The optical detection system offers the flexibility to detect a broad range of sequence-dependent (e.g., HybProbe probes and hydrolysis probes) and sequence-independent probes(e.g., SYBR Green I).LightCycler 480仪器有很高的灵活性，支持多种荧光分析格式，可使用广谱探针和染料：1、序列非依赖检测法 依靠能与所有双链DNA分子结合的荧光基团，与序列无关；例如 SYBR Green I。2、序列特异性探针结合检测法 依靠序列特异性寡核苷酸探针偶联荧光基团，探针能与靶PCR产物内的互补序列相结合 单标记探针（SimpleProbe化学） 杂交探针（HybProbe 化学） 水解探针（5-核酸酶测定法）HybProbe 探针化学法和水解探针化学法利用的是荧光共振能量转移（FRET）原理。此原理的基础是荧光基团（供体）能量传输到另一个临近的荧光基团（受体）。下列是FRET发生的主要条件： 供体分子和受体分子之间必须相互靠近 受体的激发光谱与供体荧光发射光谱必须有重叠 供体和受体的偶极取向必须临近平行供体染料由LightCycler 480仪器光源通过选择匹配染料最大吸收波长的激发滤光片而激发（例如选择465 nm波长激发滤光片用于激发荧光素）。此波长激发供体内一定数量的电子从基级跃入较高的能量级位。此能量由下列释放： 发射出具有不同的、更长波长的荧光 传输能量传输至受体染料（如LightCycler Red 640）。能量释放时，电子恢复到基级水平。供体将能量传输至受体分子使自身荧光淬灭。FRET法可以以不同的形式在PCR中用于产生序列特异性信号。水解探针化学法的基础是淬灭供体染料的荧光（供体染料因此被称为淬灭剂），HybProbe化学法则利用受体染料发射荧光。用SYBR Green I染料监测PCR 检测PCR 产物的产生可以通过测量SYBR Green I荧光信号实现。SYBR Green I可嵌入双链DNA螺旋环中。溶液中未结合的染料发射的荧光非常微弱；但是，一旦与DNA结合后，由于构象的改变，其荧光（530 nm测量）就会显著增强。因此，在PCR的过程中，SYBR Green I荧光的增加是与产生的双链DNA呈正比。由于SYBR Green I染料本身性质非常稳定，因此可以选择为测量总DNA数量的试剂。下列是在LightCycler 480系统实时PCR中，使用SYBR Green I染料检测DNA的基本步骤：由于SYBR Green I染料能和所有的双链DNA结合，因此SYBR Green I 检测格式不能区分不同的双链DNA种类。特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体都能同样地被检测到。所有双链PCR人工产物都会强化信号强度，导致靶序列浓度检测过高。确定是否所需的PCR产物已经扩增可以在完成PCR后通过熔解曲线分析而实现。通过熔解曲线分析及鉴定PCR产物的基础是每一种特殊的双链DNA分子有其自身特征性的熔解温度Tm，达到这个温度时，一半的DNA为双链，另一半为熔解状态，即单链。确定双链DNA热稳定性最重要的因素是DNA分子的长度和GC含量。在分析熔解曲线时，反应混合物缓慢加热至95C，在这样情况下达到混合物内PCR产物的Tm温度时，能引起双链DNA熔解以及相应的SYBR Green I荧光急剧减少。LightCycler 480仪器持续地监测超过Tm温度后的荧光转变。使用LightCycler 480基础软件分析熔解曲线时，这些数据以熔解曲线图的方式显示出来（荧光F对温度T）。从熔解曲线的回折点上能估计出反应中PCR产物的Tm温度。但是使用LightCycler 480基础软件Tm调集分析模式绘制出衍生熔解曲线（-dF/dT），能更为容易地辨别出Tm温度。衍生熔解曲线的峰中心对应于回折点。如果PCR只产生一个扩增子，那么熔解曲线分析将只能显示一个熔解峰。如果存在引物二聚体或其他非特异性产物，他们以附加熔解峰的形式显示出来。因此验证PCR产物的Tm温度可以与分析凝胶电泳产物的长度相比较。使用水解探针监测PCR 单链3-非延伸性（已磷酸化处理）探针用于检测特异性靶DNA序列的增加，因此水解探针测定法技术上可描述为同源性5-核酸酶测定法。单链3-非延伸性探针在扩增时可被剪切。这种单链探针含有两个指示染料，即一个荧光报告基因和一个淬灭剂，这两个指示物相互之间的距离很接近。探针完整无缺时，淬灭剂染料与报告基因染料的距离很接近，能充分地抑制报告基因荧光信号的发射（荧光淬灭通过FRET产生）。PCR过程中，聚合酶5-核酸酶剪切水解探针，使报告基因和淬灭剂分开。被剪切的探针上的报告基因不再被淬灭，激发后发射出荧光信号。 LightCycler 480仪器能检测出标记有报告染料的水解探针，如LightCycler Cyan 500、FAM、HEX、LightCycler Red 610、LightCyclerRed 640 或 Cy5。水解探针可单独或联合使用，这样能进行单色或多色检测。使用HybProbe探针监测PCR HybProbe 探针检测格式中，有两个专门设计、序列特异性的寡核苷酸探针以头对尾排列的方式与扩增的DNA片段上的靶序列杂交。这两种探针称之为供体和受体，都标有不同的荧光染料，从而使两种不同的染料紧密接近。供体染料（如荧光素）由合适的激发滤光片（465 nm）激发。当两种染料相互靠近时，供体染料释放出的能量激发受体染料（如LightCycler Red 640），受体染料此时附着于第二个HybProbe探针和寡核苷酸杂交复合物上。受体染料激发后发射出不同波长的荧光，其荧光量与PCR产生的靶DNA数量成正比。HybProbe检测格式适合于序列特异性qPCR检测和基因分型（单核苷酸多态性检测，SNP）。利用HybProbe探针检测SNP是以熔解曲线分析为基础的。温度低于寡核苷酸的Tm 温度时，HybProbe探针配对与互补模板结合，导致锚定探针与感应探针紧密靠近，产生FRET。随着温度上升，探针在其对应的Tms温度时熔解，不再产生FRET。熔解与荧光信号强度下降同时发生。感应探针熔解的温度依赖探针的基本序列。因此，如果模板的感应探针结合区存在一个SNP，结合的复合物会不稳定，其熔解温度低于正确配对的复合物。使用SimpleProbe探针研究基因分型 SimpleProbe探针是一类特殊类型的杂交探针。这些探针有一个重要方面不同于HybProbe探针。这种探针测定法无需联合使用两个探针，它只需要单个探针。这种单个探针可以和含有所寻找的SNP的靶序列特异性结合杂交。一旦杂交后，SimpleProbe探针发射出的荧光信号强度超过未杂交时所发射的荧光强度。因此，SimpleProbe探针的荧光变化只依赖于杂交状态。SimpleProbe检测格式的原理基础不是FRET理论。 典型的SimpleProbe探针设计成可以和含有所寻找的SNP的靶序列特异性结合杂交。一旦和靶序列杂交后，SimpleProbe探针发射出的荧光信号强度超过未杂交时所发射的荧光强度。因此，SimpleProbe探针的荧光变化只依赖于杂交状态。SimpleProbe探针检测格式对于SNP基因分型和变异检测是一种极好的工具，因为这种检测格式只使用一个短小的探针就可以很容易地鉴定野生体、变异体以及杂合体样本。 SimpleProbe探针可以在其两个末端或内部标记其他试剂（如标记SimpleProbe 519 Labeling Reagent试剂 * ）。如果溶液中的SimpleProbe未和其他物质结合，其报告基因染料发射的荧光会被一个特殊的非荧光淬灭剂淬灭。当探针和靶序列杂交后，淬灭效应降低，报告基因染料被LightCycler 480仪器通道激活后，发射出荧光