血球计数板使用说明.doc

血球计数板使用说明血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3. 取样：1、 样品应该保证充分的均匀的情况下才有意义；2、 样品应该尽量减少结团情况，如有结团应该吹散（或者用胰酶消化）后再计数；3、 样品的体积大概250ul（大概5-7滴）；4、 如果体积大于100ml，取样应该保证在两个以上；5、 如果是生产的技术应该取三个样，并每次都要充分混匀后取样；6、 样品的体积只有进口的离心管和吸管的数据可以取信，但是离心管会有一定的波动误差，应该计算有15ml（-100ul）50ul（-300ul）；稀释：1、 稀释液应该是等渗的，不能带有颗粒（如果有应该先用滤纸过滤）；2、 稀释的时候样品的体积至少要用50ul，同时取样前应该用200ul的枪吹打10次，并马上取样；稀释后的样品也要用200ul枪吹打10次再取样计数；3、 稀释后的样品四个中格的细胞数应该保证50-150个/中格；四个的总数应该大于200个；4、 细胞应该计数应该尽量使用原样，如果有离心操作，应该保证样品在500ul以上，并用250g 离心5min；加样：1、 计数板要用酒精清洗干净后，晾干，表面不能有污垢和纤维；2、 盖玻片应该也保持洁净，并防在血球技术板的中间位置，血球计数板要放在平面上，再每边加样，每边的加样量为8.5ul；3、 平稳放置30sec后放到显微镜上面，用100倍镜每次计数一个中方格；计数：1、 每个样品应该计数至少三次（否则会有很大偏离）；2、 每个方格的数应该在50-150间，计数的标准应该统一，如果是团就记为一个，但是可以明确分出是几个细胞的可以据实计数；3、 遵守记上不记下，记左不记右；细胞压线超过50%在线内才有效；人员：1、 人员应该做同一个样品测试，同一个样品的细胞数总量应该在10个以内（或者是5%波动）；同一个样品稀释后计数的数据波动应该在5%以内；2、 不同人员的测试同一个样品的波动误差应该在5%以内；3、 达到上诉的操作的要求的人员的操作数据才能取信；结果记录表次数ABCD稀释倍数细胞数104123.其他人对这个问题的分析【质量控制】血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差；由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（filed error）。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。质量控制一般需采用以下措施。1避免技术误差，纠正仪器误差（1）所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。计数板的鉴定：要求计数室的台面光滑、透明，划线清晰，计数室划线面积准确。必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数室的边长与底面积，用微米千分尺测量计数室的深度。美国国家标准局（NBS）规定每个大方格边长的误差应小于1%，即10.01mm，深度误差应小于2%，即0.10.002mm。若超过上述标准，应弃之不用。血盖片应具有一定的重量，平整、光滑、无裂痕，厚薄均匀一致，可使用卡尺多点测量（至少在9个点），不均匀度在0.002mm之内。必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚薄均匀。同时，合格的盖片放置在计数室表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到彩虹。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察，如见到完整平行的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也符合要求。（2）细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒，同时应该保证细胞没有明显的团块。（3）严格操作，从取样、重悬、稀释、充池到计数都应规范，尤其应注意的是样品稀释及充池时既要作到充分混匀，又要防止剧烈震荡为破坏红细胞。必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖片之间的矩形边缘为宜。（4）报告法定计量单位。2缩小计数域误差或分布误差 由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poisson分布，而我们所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。欲将误差控制在变异百分数5%以内，至少需要在计数室中计数400个细胞，因此要求计数五个中方格的细胞。3人员质量评价 一般用两差比值法或双样试验标准差评价法进行质量评价或工作人员自我考核；变异百分数法通常用于评价细胞计数的结果。（1）两差比值法 用于考核实验结果的精密度。采用同一稀释样间隔2h后进行重复计数，求出两次镜下计数值之差（取绝对值）与两次计数值标准差的比值，即两差比值（r）。评分：score=100-20.1r，20.1为失分系数（40/1.99）。评级：90-100 为优秀，80-89为良好，70-79为中等，60-69为及格，60时为不及格。X1和X2分别为前后两次镜下计数值，而非换算后的细胞浓度，r2为合格，r2说明两次计数值的差异具有显著意义。也可以用这种方法评价治疗效果是否显著，方法是采用该公式计算同一患者治疗前和治疗一段时间后两次镜下计数值的差异。（