双向电泳笔记.doc

1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液：将蛋白溶解在：8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。 溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法： 7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚蓝。2. 为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。 将组织在研钵中用液氮研碎。将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。在-18C 条件下过夜并离心。用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素，2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。*不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG胶条密封好在-20以下温度保存。再水化至少需要十个小时。矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。*聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。4.可选操作：加入分子量标准蛋白。分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，然后加入到等电聚焦上样滤纸片上能得到很好的效果。终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。其它可选的方法是，将标准蛋白以15-20 l的体积加入到等电聚焦上样滤纸片上。如要少加样量，将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上。然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧的凝胶表面。进行考马斯亮蓝染色标准溶液的各种蛋白成分必须含有200-1000 ng；而进行银染色必须在10-50 ng之间。5.*上下电泳槽大概需要加多少电极缓冲液使上下电极与缓冲液相接触？问题可能原因解决方法开始电泳时无电流。在上下电泳槽中缓冲液体积不够。确保两个缓冲液储液槽盛有足够的SDS电泳缓冲液，使上下电极与缓冲液相接触。第二向电泳分离速度太慢。SDS电泳缓冲液制备不正确或溶解凝胶缓冲液制备不正确。重新配制新鲜的溶液。丙烯酰胺溶液储存时间太久。配制新鲜的单体储存液。染料前沿边缘向上弯曲（微笑样）凝胶没有正确降温。在电泳过程中，用恒温循环水浴对凝胶进行冷却降温。在底部储存槽中尽可能多地使用缓冲液。电流强度或功率过大。按表 20推荐值限定电流或功率染料前沿向下弯（皱眉样）凝胶在垫片附近聚合不完全。除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。仪器安装不正确（SE600）。确保密封管条没有收缩。上部储液槽渗漏。在上部储液槽中确保有足量的缓冲液。第二向分离电流高、速度慢密封装置的槽未被胶模具或空白插板由于阴极或阳极缓冲液过量导致两种缓冲液混合确认12个插槽都被占满下槽不要超过建议体积(7.5 L)。电泳单元完全装好后确认阳极液面没有超过密封装置。如果多余的阳极缓冲液在上槽，需要排出。确认阴极缓冲液的液面没有超过上槽角落的通气孔。可通过在装胶前向下槽加入溴酚蓝染料来加入来检查上下槽的混合。几滴1%溴酚蓝足够染阴极液染料前沿不规则。凝胶聚合不均匀。第二向上表面不平在放置IPG胶条时破坏了凝胶上表面凝胶与玻璃板之间存在气泡凝胶和玻璃板之间存在液体除去凝胶溶液中的气体或增加过硫酸铵和TEMED量的50%。灌胶后立即用水饱和丁醇来覆盖凝胶表面在放置IPG胶条时小心不要损坏凝胶用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动凝胶一侧染料前沿明显向下弯曲凝胶与垫片之间的缝隙未被填充预制凝胶模具未正确合住在封IPG胶条时，确认密封液也封住凝胶与垫片之间的缝隙确认模具合闭正确，重新电泳2-D图像扭曲凝胶与玻璃板之间存在气泡凝胶与玻璃板之间存在液体第一向存在干扰性物质用滚子除去凝胶和玻璃板之间的气泡和多余的液体确认无可见的气泡，凝胶紧贴着玻璃板，不可移动样品中的干扰性物质会导致扭曲或IPG胶条局部肿胀，这些变化又会影响第二向。改变样品制备方法限制污染物2-D图像垂直缺失IPG胶条和第二向凝胶上表面之间存在气泡确认IPG胶条和第二向凝胶上表面之间没有气泡垂直拖尾平衡液配制不正确蛋白从IPG胶条向第二向转移不充分平衡不够根据说明准备平衡液在转移步骤中采用低功率和低电流。如果需要延长转移步骤时间延长平衡时间垂直出现双点或“重点”IPG胶条放置不正确确认IPG胶条的塑料支持膜紧贴着第二向胶的玻璃板高分子量蛋白损失平衡液准备不正确蛋白从IPG胶条向第二向转移不充分根据说明准备平衡液在转移步骤中采用低功率和低电流。如果需要延长转移步骤时间干胶条的尖端是酸性端，应当正对着正极（+）。6. 12.5%凝胶制备：丙烯酰胺16.7ml； 分离胶缓冲液10ml ；10SDS 400l；无菌水12.8ml；10过硫酸胺200l ；TEMED*13.3l*在灌胶之前加入，药品配制：丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml 封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）7.植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸丙酮沉淀法 （1）在液氮中研磨叶片（2）加入样品体积3倍的提取液在-20的条件下过夜，然后离心（48000rpm以上1 小时）弃上清。（3）加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的-巯基乙醇），摇匀后离心（48000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。（4）上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（158000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4待用。（5）用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80备用。药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 8.蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%- 巯基乙醇），混匀，-20沉淀1 小时，4，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mM-巯基乙醇），再于-20沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mM-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每mg干粉加入20l（可调）UKS液9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫苏糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100，37 育30min，（含有尿素的溶液加热温度不能超过30）期间搅动几次，16000 r/min离心15 min28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰），离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存9.双向电泳操作步骤及相关溶液配置一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、实验步骤：1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白：100ul裂解液）振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔 1015分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80保存。2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul，5ul，10ul，15ul，20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液（10l上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40l 水及50l 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100l冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100l PBS溶液（磷酸盐缓冲液）复溶），再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的 Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品 OD值。（测量过程要在一个小时内完成）。3. 双向电泳第一向IEF（双向电泳中一律使用超纯水）3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后，加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer （pH 3-10）振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合，13200rpm离心15min除杂质，取上清。3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels （18cm，pH 3-10）胶条，从正极到负极将胶条压入槽中，胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油（Bio-Rad），两个上样槽必须与底线齐平。3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20）S1 （30v, 12hr, 360vhs, step）S2 （500v, 1hr, 500vhs, step）S3 （1000v, 1hr, 1000vhs, step）S4 （8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad）S5 （8000v, 5hr, 40000vhs, step） 共计44110vhs, 19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦3.4 平衡用镊子夹出胶条，超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A,平衡液B先后平衡15min. 注：平衡时要注意保持胶面始终向上，不能接触平衡管壁。平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker,转入SDS-PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml.4. 双向电泳第二向SDS-PAGE4.1 配胶（两根胶条所用剂量）4.2 灌胶将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶，倒入浓缩胶，正丁醇压胶，凝胶后，用注射器吸去正丁醇，超纯水洗两次，再加入超纯水，用保险膜封好。4.3 转移剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS-PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上，加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上（琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好，水浴加热溶解，并保持烧杯中水处于沸腾状态，至用之前再拿出来），再将IPG胶条缓缓加入SDS- PAGE胶面，其中不断补加5%的琼脂糖溶液，注意不能产生气泡。4.4 跑胶浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小时实验相关试剂配制1.Bradford 工作液95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml.过滤后置于棕色瓶考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效）2.裂解液尿素 8M硫脲 2MCHAPS 4%DTT 60 mMTri