药典常用定量分析方法概述

盐城卫生职业技术学院林QQ 505348076 E mail linruirQQ 56334613 E mail linruir 第四章药典中常用定量分析方法概述Chapter4Assay 药物分析技术TechnologyofPharmaceuticalAnalysis 学习目标 在回顾总结常见定量分析方法的基础上 介绍了常见定量分析方法在 中国药典 现行版中的应用 通过本章的学习 为理解好掌握后面药物的含量测定打下坚实基础 重量分析法酸碱滴定 非水酸碱滴定法 配位滴定容量分析法沉淀滴定分氧化还原滴定纸色谱PC析电化学分析法平面色谱化经典色谱薄层色谱TLC学 色谱分析柱色谱法 CC 气相色谱法 GC 现代色谱 高效液相色谱法 HPLC 高效毛细管电泳法 HPCE 紫外 可见分光光度法 UV Vis 红外分光光度法IR原子吸收分光光度法 AAS 光谱分析原子发射分光光度法 AES 或波谱分析荧光分析法 Fluor 核磁共振法 NMR 质谱法 MS 电导法 电位法 伏安法 电化学分析法 电解法 极谱法 续前 按任务分定性分析定量分析结构分析 鉴定组成 测定含量 研究结构 按对象分无机分析有机分析 鉴定组成和测定含量 官能团的分析和结构鉴定 按测定原理分化学分析仪器分析 重量分析 滴定分析 光学分析 电分析 色谱分析NMR MS 电子显微镜 x 射线分析 知识要求 掌握常见定量分析方法的基本原理 在药物分析中的测定方法及分析结果的计算 熟悉常见定量分析方法在使用中的注意事项 了解其他定量分析方法及高效液相色谱仪 紫外 可见分光光度计等仪器的结构 Ch4 1 1重量分析法 通过称量被测组分的质量来确定被测组分百分含量的分析方法 分类 挥发法萃取法沉淀法 特点 准确度高 费时 繁琐 不适合微量组分 Ch4 1 2酸碱滴定法 容量分析法 滴定分析法 将一种已知准确浓度溶液 滴定液 滴加到待测物质的溶液中 直到化学反应按计量关系完全作用为止 然后根据所用滴定液的浓度和体积计算出待测物质含量的一种分析方法 酸碱滴定法 中和法 以酸 碱中和反应为基础的滴定分析法 以酸 碱 性滴定液滴定到被测物质 以酸碱指示液或仪器指示终点 根据酸 碱 滴定液的浓度好消耗的体积 计算出被测物质的含量 酸碱的定义 电离理论电子理论质子理论 应用 直接滴定法 Ca Ka1 10 8的弱酸Cb Kb1 10 8的弱碱剩余滴定法 非水溶液滴定法non aqueoustitrationmethod 非水溶液酸碱滴定法是以非水溶剂作为滴定介质 不仅可增大有机物的溶解度 还可改变溶液的酸碱性 克服在水溶液中滴定的困难 从而扩大酸碱滴定的应用范围 酸碱滴定一般是在水溶液中进行 以水为溶剂既价廉又安全 但是也会受到一定的局限性 如 弱酸或弱碱在水溶液中没有明显的滴定突跃 有机酸或碱在水中溶解度较小 还有一些多元酸或多元碱 混合酸 碱 由于它们的离解常数较接近 在水中不能分步或分别滴定 1 非水酸量法non aqueousacidimetry滴定液 甲醇钠的苯 甲醇溶液 指示剂 邻硝基苯胺 溶剂 二甲基甲酰胺 2 非水碱量法non aqueousalkalimetry滴定液 高氯酸二氧六环溶液指示剂 甲基红结晶紫溶剂 冰醋酸醋酐 Ch4 1 3氧化还原滴定法 以氧化还原反应为基础的滴定分析方法 实质 电子的转移特点 1 机理复杂 多步反应2 有的程度虽高但速度缓慢3 有的伴有副反应而无明确计量关系分类 碘量法 高锰酸钾法 重铬酸钾法 亚硝酸钠法 溴量法 铈量法应用 广泛 直接或间接测定无机物 有机物 一 碘量法 利用I2的氧化性和I 的还原性建立的滴定分析方法 注 pH 9时 不受酸度影响 应用范围更为广泛 电对反应I2 2e2I I2 I I3 助溶 I3 2e3I 一 直接碘量法 利用I2的弱氧化性质滴定还原物质 测定物 具有还原性物质 可测 S2 Sn S2O32 SO32 酸度要求 弱酸性 中性 或弱碱性 pH小于9 强酸性介质 I 发生氧化导致终点拖后 淀粉水解成糊精导致终点不敏锐强碱性介质 I2发生歧化反应 3I2 6OH 5I IO3 3H2O 歧化反应 4I O2 4H 2I2 2H2O 氧化反应 二 间接碘量法 利用I 的中等强度还原性滴定氧化性物质 测定物 具有氧化性物质 可测 MnO4 Cr2O7 CrO4 AsO43 BrO3 IO3 H2O2 CLO Cu2 酸度要求 中性或弱酸性强酸性介质 S2O32 发生分解导致终点提前 I 发生氧化导致终点拖后碱性介质 I 与S2O32 发生副反应 无计量关系 S2O32 2H SO2 S H2O 分解 4I2 S2O32 10OH 8I 2SO42 5H2O 三 碘量法误差的主要来源 1 碘的挥发预防 1 过量加入KI 助溶 防止挥发增大浓度 提高速度2 溶液温度勿高3 碘量瓶中进行反应 磨口塞 封水 4 滴定中勿过分振摇 2 碘离子的氧化 酸性条件下 预防 1 控制溶液酸度 勿高 2 避免光照 暗处放置 3 I2完全析出后立即滴定4 除去催化性杂质 NO3 NO Cu2 四 标准溶液的配制与标定 1 NaS2O3溶液 A 配制 不稳定原因a 水中溶解的CO2易使NaS2O3分解S2O32 CO2 H2O HSO3 HCO3 S b 空气氧化 2S2O32 O2 SO42 S c 水中微生物作用 S2O32 Na2SO3 S 配制方法 煮沸冷却水 加入NaCO3使pH 9 10 放置7 8天 过滤 B 标定 续前 Cr2O72 6I 过量 14H 2Cr3 3I2 7H2O 酸度高 I2 2S2O32 2I S4O62 加水稀释 弱酸性 I2 2S2O32 2I S4O62 加水稀释 弱酸性 K2CrO7基准物标定法I2标液比较法 续前 2 碘标准溶液 A 配制 避光 防止I I2 注 不可用分析天平称 B 标定 As2O3基准物质标定法NaS2O3标准溶液比较法 As2O3 6OH 2AsO33 3H2OAsO33 I2 2H2OH3AsO4 2I H 五 淀粉指示剂 要求 室温 弱酸性 新鲜配制加入时间 直接碘量法 滴定前加入 终点 无色 深蓝色 间接碘量法 近终点加入 终点 深蓝色消失 变色原理 注 间接碘量法中淀粉指示剂过早加入 强烈吸附I2 造成终点拖后 I2 过量 I I3 与淀粉形成深蓝色配合物 六 应用与示例 1 直接碘量法 指示剂加入时间 滴定前加入终点 无色 深蓝色例 Vc的测定 2 间接碘量法指示剂加入时间 近终点加入终点 深蓝色消失1 剩余碘量法 返滴定法 例 葡萄糖的测定2 置换碘量法例 CuSO4的含量测定 剩余碘量法测葡萄糖的含量 注 无须知道CI2 葡萄糖 I2 定过量 葡萄糖酸盐I2 剩余 2Na2S2O32NaI Na2S4O6 置换碘量法测定CuSO4的含量 注 CuI易水解 故以HAc为介质CuI强烈吸附I2造成终点提前 滴定时应用力振摇或加入KSCN转化CuI沉淀为CuSCN 同时释放I2 2Cu2 4I 过量 2CuI I2I2 2S2O32 2I S4O62 Ch4 1 5沉淀滴定法 通过本章的学习 能熟练运用铬酸钾指示剂法 铁铵矾指示剂法 吸附指示剂法和电位滴定法的原理测定难溶性银盐化合物的含量 这为后期进行药物分析课程的学习奠定基础 吸附指示剂法 Fayans法 法扬司法 吸附指示剂法 利用沉淀对有机染料吸附而改变颜色来指示终点的方法吸附指示剂 一种有色有机染料 被带电沉淀胶粒吸附时因结构改变而导致颜色变化 原理 SP前 HFLH FL 黄绿色 AgCL CL 吸附过量CL SP时 大量AgCL Ag FL 淡红色 双电层吸附 滴定条件及注意事项a 控制溶液酸度 保证HFL充分解离 pH pKa例 荧光黄pKa7 0 选pH7 10曙红pKa2 0 选pH 2二氯荧光黄pKa4 0 选pH4 10b 防止沉淀凝聚措施 加入糊精 保护胶体c 卤化银胶体对指示剂的吸附能力 对被测离子的吸附能力 反之终点提前 差别过大终点拖后 吸附顺序 I SCN Br 曙红 CL 荧光黄例 测CL 荧光黄测Br 曙红 D 避免阳光直射E 被测物浓度应足够大F 被测阴离子 阳离子指示剂被测阳离子 阴离子指示剂 适用范围 可直接测定CL Br I SCN 和Ag 电位滴定法 原理 是一种容量分析中确定终点或选择 核对指示剂变色域的方法 应用标准溶液滴定待测物溶液过程中 借助指示电极 参比电极和电位计来监测滴定时电极电位的变化率 发生 突跃 的最大点就是滴定的终点 以替代一般指示剂用变色来指示终点的方法 应用 酸碱滴定法 PH V 含非水 沉淀滴定法 PAg V络合滴定法 PM V氧化还原滴定法 E V 2 终点指示方法 学习目的 Ch4 1 6配位滴定法 学习目标知识目标掌握EDTA的性质和与金属离子配位反应的特点 金属指示剂的变色原理 具备条件和常用金属指示剂 EDTA滴定液的配制和标定 熟悉影响配位反应平衡的因素 配位滴定酸度条件的选择及配位滴定法在药物分析中的应用 了解副反应和副反应系数及条件稳定常数的意义 能力目标熟练应用掌握EDTA滴定液的配制 标定和直接测定金属离子的含量的操作技能和计算 学会用返滴定法测定铝盐的操作技术和计算 氮测定法 凯氏定氮法 药物分析杜马氏法 元素定量分析范斯莱克法 生化分析 氨基氮测定 1 原理含氮供试品与浓硫酸共热 供试品中所含氮转变成氨 并与硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵 用氢氧化钠碱化后 释出氨 随水蒸气馏出 用硼酸溶液或定量的酸吸收后 用标准酸液或标准碱液滴定 用空白试验校正 凯氏定氮法分为3个步骤 1 消解 凯氏烧瓶中进行 将样品 Con H2SO4 K2SO4 CuSO4放入凯氏烧瓶中一起加热 有机含N化合物中的N全部转变成NH3并以铵盐的形式固定 NH4 2SO4 NH4HSO4 H2SO4 氧化剂和炭化剂 SO2和SO3消解一般在通风橱中进行 K2SO4 提高H2SO4沸点缩短消解时间 CuSO4 催化剂 使消解速度加快 消解产物 NH4 2SO4 NH4HSO4 2 蒸馏与吸收 用40 的NaOH溶液水蒸气蒸馏 NH4 2SO4 2NaOH Na2SO4 2NH3 2H2ONH4HSO4 NaOH NaHSO4 NH3 H2O 3 测定 直接滴定法 吸收液 2 硼酸溶液滴定液 0 005mol LH2SO4液每1ml的0 005mol LH2SO4液 0 1401mg的N指示剂 甲基红 溴甲酚绿混合指示剂终点颜色 灰紫色NH3 H3BO3 NH3 H3BO32NH3 H3BO3 H2SO4 NH4 2SO4 2H3BO3 剩余滴定法 用标准盐酸或硫酸作吸收液 将蒸馏出来的NH3吸收于定过量的标准酸溶液中 过量的酸用标准碱溶液滴定 永停滴定法 1 原理 测量时 把两个相同的铂电极插入滴定溶液中 在两个电极间外加小电压 10 200mv 进行滴定 根据电流变化情况确定终点 可逆电对 I2 I 两个铂电极间外加一个小电压 接正端的电极发生氧化反应 2I I2 2e 接负端的电极发生还原反应 I2 2e 2I 即发生电解 只有两个电极上都发生反应 他们之间才会有电流通过 I2 I 在溶液中与双铂电极组成电池 给一个很小的外加电压就能产生电解 有电流通过 称为可逆电对 可逆电对与不可逆电对 电对的氧化态和还原态浓度相等时电流最大 不相等时电流的大小决定于浓度低的那个氧化态和还原态的浓度 不可逆电对 S4O62 与S2O32 S4O62 S2O32 三永停滴定法 永停滴定法 利用上述现象确定滴定终点的方法 2 指示终点的方法 滴定剂属可逆电对 被测物属不可逆电对如 I2滴定Na2S2O3 终点前 a 溶液中只有S4O62 S2O32 电对 虽有外加电压 也不能产生电解 b 溶液中虽有I 阳极上有I 氧化成I2的可能性 无I2 故电解反应同样不能发生 所以 终点前电流计指针一直在0电流位置上不动 第二节药典常用分析方法 三永停滴定法 终点时 达到终点有稍过量的I2 溶液中有I2 I 可逆电对 电极上产生电解反应 有电流通过 电流计指针开始偏转并不再返回0 指示滴定终点到达 终点后 随I2浓度的逐渐增加 电解浓度逐渐增大 滴定剂为不可逆电对 被测物为可逆电对如Na2S2O3滴定I2 终点前 即存在I2 I 的可逆电对 有电流通过 滴定越接近终点 I2的浓度逐渐变小 电流逐渐变小 终点时 由于I2浓度为0 电解电流变为0 指针突然下降并停留在0电流的位置保持不动 指示滴定终点到达 终点后 溶液中只有S4O62 S2O32 的不可逆电对 无电解发生 电流降到最低点并不在变化 滴定剂与被滴定剂均为可逆电对如Ce4 滴定Fe2 滴定前 溶液中只有Fe2 无Fe3 存在 阴极上不可能有还原反应 无电解反应 无电流通过 滴定时 当Ce4 Fe3 Fe3 Fe2 可逆 电流不断 当 Fe3 Fe2 时 电流达到最大值 继续加入Ce4 Fe2 电流 终点时 电流降至最低点 阳极 O Fe2 Fe3 e阴极 H Fe3 e Fe2 第二节药典常用分析方法 三永停滴定法 终点后 Ce4 过量 溶液中有Ce4 Ce2 可逆电对 Ce4 不断 电流又开始上升 阳极 O Ce2 Ce4 2e阴极 H Ce4 2e Ce2 第二节药典常用分析方法 三永停滴定法 3 应用 1 重氮化滴定法的终点指示 2 在用KarlFisher法测定微量水分时的终点指示 自习 二 光学分析法及其分类 一 光学分析法依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称 二 分类 1 光谱法 利用物质与电磁辐射作用时 物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收 发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性 定量分析方法 2 非光谱法 利用物质与电磁辐射的相互作用测定电磁辐射的反射 折射 干涉 衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类 折射法 旋光法 比浊法 射线衍射法 3 光谱法与非光谱法的区别 Ch4 2紫外 可见分光光度法 紫外 可见吸收光谱 UltravioletandVisibleSpectroscopy UV VIS 统称为电子光谱 紫外 可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收200 800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法 这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁 广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定 原理 根据Lambert Beer定律A ECLE 吸收系数C 单位浓度L 液层厚度 吸收系数有两种 摩尔吸收系数 指在一定波长下 溶液浓度为1mol L厚度为1 时的吸收度 百分吸收系数 指在一定波长下 溶液浓度为1 W V 厚度为1 的吸收度 与E关系E 吸收物质的摩尔质量 分子量 强吸收度 104 105弱吸收度 102中强吸收 102 104 2 应用 定性鉴别 max及 或EA max A min与标准品溶液的吸收光谱比较 纯度检查 在某波长 药物无吸收 而所含杂质有吸收 可检查某杂质的限度 如 肾上腺素中肾上腺酮的检查 肾上腺素2mg mL的0 05mol LHCl液 310nm处测得的A 0 05 肾上腺铜的E 435 求其限量 含量测定 a 单组分的测定方法 b 两组分测定方法 计算分光光度法 2 荧光分析法 原理 物质在受到激发光 ex 照射后产生了较长波长的荧光 em 溶液的荧光强度和溶液的吸光程度 溶液中荧光物质的荧光效率等因素有关 F 荧光强度K 荧光效率I0 入射光强度C 荧光物质的浓度E 吸收系数l 液层的厚度 应用 鉴别 ex和 em荧光激发光谱 发射光谱 含量测定 a 标准曲线法 b 比例法 对照法 说明 a 药物本身无荧光 加衍生试剂 荧胺 邻苯二甲醛 OPA 丹酰氯 使成荧光物质后测定 b 荧光测定影响因素多 溶剂 pH值 散射光 荧光物质浓度故做空白试验 不易测得绝对荧光强度 3 红外分光光度法 原理 由分子的振动及转动能级跃迁而引起的 一束具有连续波长的红外光通过物质时 当物质分子中某个基团的振动频率和红外光的频率一致时 分子便吸收能量并发生跃迁 根据分子吸收红外光的情况进行分析的方法为红外分光光度法 应用 已知化合物的鉴定 a 同时测定样品和标准品吸收光谱b 样品图谱与标准品的吸收光谱比较 未知化合物的研究 有机化合物官能团推定结构细节 如共轭结构 脂环 芳环及其取代情况等推定分子骨架 功能团位置和分子的主体结构 药物的纯度检查杂质有自身吸收峰 使纯物质红外光谱吸收峰增多 通过图谱可推断含有某杂质 含量测定 选择一个预测成分的特征吸收峰 此吸收峰不被其他成分干扰即可 定量时多采用内标法 依对照品比较法公式计算含量 红外吸收光谱特征性较强常用于物质的鉴定时比UV法更可靠 操作麻烦 测定的准确度及精密度 不如UV法 用作含量测定的较少 四光谱法 TLC 原理 吸附剂对不同化合物的吸附力不同 展开剂对各组分的溶解解吸能力不同 使待分离的组分Rf值不同 不同物质最后形成相互分离的斑点 应用 定性分析样品 对照品在同一薄层板上点样展开要求Rf值斑点颜色一致 杂质检查 对照品对照法高低浓度对照法 杂质斑点的数目及颜色不得超过规定 第二节药典常用分析方法 五色谱法 定量分析 c 采用薄层扫描仪直接在薄层板上测定 a 目视法 b 浦集斑点洗脱后测定 2 气相色谱法 GC 原理样品中各组分在固定相与载气间分配 由于各组分的分配系数不同而分离 一般要求 ChP 载气 N2 色谱柱 填充柱毛细管柱 进样口温度 高于柱温30 50 进样量 不大于数微升 检测器 常用氢焰离子化检测器 FID 检测温度一般高于柱温 不得低于100 以免水气凝结 常用250 350 系统适用性试验 ChP 色谱柱的理论板数 n 分离度 R 拖尾因子 重复性取各品种项下的对照溶液 连续进样5次 除另有规定外 其峰面积测定值的相对标准差应 2 0 第二节药典常用分析方法 五色谱法 应用 定性 根据tR 含量测定 a内标法b外标法 杂质检查 a峰面积归一化法b主成分自身对照法c内标法测定供试品中杂质的总量限度d内标法加校正因子测定供试品中某个杂质含量e外标法测定供试品中某个杂质的含量 HPLC 分类 液 固吸附柱色谱法 液 液分配柱色谱法 离子交换柱色谱法 分子排阻塞谱法 第二节药典常用分析方法 五色谱法 液 液分配柱色谱法 原理 根据物质在两相不相混容的溶剂间溶解度不同 而具有不同分配系数 从而达到分离 第二节药典常用分析方法 五色谱法 常用反相液 液色谱法 流动相 水 甲醇 水 乙腈 水固定相 十八烷基硅烷键合硅胶 ODS或C8 第二节药典常用分析方法 五色谱法 系统适用性试验应用 鉴别 检查 含量测定同GC 第四章药物定量分析与分析方法验证第一节定量分析样品的前处理方法一 概述含金属或卤素的药物 如葡萄糖酸锑钠 硬脂酸镁 碘苯酯 磺溴酞钠等 在分析前需要经过不同方法处理之后 方可进行测定 处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异 如 有机卤素药物 所含卤素原子均直接与碳原子相连 但不同药物中卤素所处的位置不同 则与碳原子结合的牢固程度就有差异 如果卤素和芳环相连接 则结合牢固 与脂肪链的碳原子相连接 则结合不牢固 而含金属的有机药物 有两种情况 一是金属原子不直接与碳原子相连 通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物 称为含金属的有机化合物 其分子结构中的金属原子结合不够牢固 在水溶液中既可离解出金属离子 如有机结构部分不干扰分析时 可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量定 二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接 结合状态比较牢 称为有机金属药物 在溶液中其金属一般不能解离成离子状态 应该根据共价键的牢固程度 经适当处理 将其金属转变为适于分析的状态 应该根据共价键的牢固程度 经适当处理 将其金属转变为适于分析的状态 多转变为无机的金属盐或离子 方可进行其金属的鉴别或含量测定 二 不经有机破坏的分析方法 一 直接测定法凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些C M 金属原子直接与碳原子相连 键结合不牢固的有机金属药物 在水溶液中可以电离 因而不需有机破坏 可直接选用适当的方法进行测定 二 经水解后测定法1 直接回流后测定法2 用硫酸水解后测定法 三 经氧化还原后测定法1 碱性还原后测定 2 酸性还原后测定3 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量三 经有机破坏的分析方法 一 湿法破坏1 硝酸 高氯酸法2 硝酸 硫酸法3 硫酸 硫酸盐法4 其它湿法 二 干法破坏 三 氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法 oxygenflaskcombustionmethod 系将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧 并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中 然后根据欲测物质的性质 采用适宜的分析方法进行鉴别 检查或测定含卤素有机药物或含硫 氮 硒等其它元素的有机药物 本法是快速分解有机物的简单方法 它不需要复杂设备 就能使有机化合物中的待测元素定量分解成离子型 该方法被各国药典所收载 1 仪器装置燃烧瓶为500ml 1000ml 或2000ml磨口 硬质玻璃锥形瓶 瓶塞应严密 空心 底部熔封铂丝一根 直径为1mm 铂丝下端做成网状或螺旋状 长度约为瓶身长度的2 3 如图 2 称样3 燃烧分解操作法4 吸收液的选择 第二节定量分析方法的特点 容量分析法光谱分析法色谱分析法 容量分析法 容量分析法 用已知浓度的标准溶液 滴定一定体积的待测溶液 直到化学反应完全为止 到达终点 根据标准溶液的体积和浓度计算待测物质含量的方法 特点 简便 快速 准确度高 专属性较差 化学原料药分析 容量分析法 滴定度每1ml标准滴定液相当待测物的mg数 滴定度计算 容量分析法 直接滴定法的结果计算 V为滴定液的消耗体积 ml T为滴定度 W为供试品的称样量 g 10 3为质量换算因数 1mg等于10 3g F为滴定液的浓度校正因数 光谱分析法 光谱分析法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度 对该物质进行定性 定量分析的方法 单色光穿过吸光物质溶液时 在一定的浓度范围内 被该物质吸收的光量与该物质溶液的浓度和液层的厚度 光路长度 成正比 其关系式如下 紫外 可见分光光度法 紫外 可见分光光度法用于药物含量测定的方法有三种 1对照品比较法分别配制供试品和对照品溶液 在规定波长处分别测定吸光度 按下式计算供试品溶液中被测组分的浓度 CX AX AR CR2吸收系数法按各品种项下方法 配制供试品溶液 在规定波长处测定其吸光度 再根据吸收系数按下式计算供试品溶液的浓度 紫外 可见分光光度法 3比色法供试品本身在紫外 可见区没有强吸收 或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度 可加入适当的显色剂显色后测定用比色法测定时 由于显色时影响的因素较多 应取供试品与对照品同时操作 除另有规定外 比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液 然后依次加入等量的试剂 并用同样方法处理 在规定的波长处测定吸光度后 按对照品比较法公式计算供试品溶液的浓度 色谱法 色谱法 chromatography 是利用混合物不同组分在两相中具有不同的分配系数 或吸附系数 渗透性等 当两相作相对运动时 不同组分在两相中进行多次反复分配实现分离后 通过检测器得以检测 进行定性定量分析 色谱系统适用性试验 系统适用性试验指用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整 应达到的要求 系统适用性试验通常包括最小理论板数 分离度 重复性和拖尾因子 一 色谱柱的理论板数 n 在选定的色谱条件下 测定主成分或内标物色谱峰的保留时间 tR 和半峰宽 W1 2 按塔板理论公式计算色谱柱的理论板数 如果测得的理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数 应改变色谱柱的某些条件 如柱长 载体性能 色谱柱填充的优劣等 使理论板数达到要求 二 分离度 R 定量分析时 为便于准确测量 要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度 除另有规定外 分离度应大于1 5 三 重复性取各品种项下的对照品溶液 连续进样5次 除另有规定外 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2 0 四 拖尾因子为保证测量精度 特别当采用峰高法测量时 应检查待测峰的拖尾因子是否符合各种项下的规定 拖尾因子 T 以下式计算 除另有规定外 T应在0 95 1 05之间 三 全面控制药品质量的科学管理 分析质量管理规范 AQC AnalyticalQualityControl 用于检验分析结果的质量 第三节药品质量标准分析方法验证验证内容有 准确度 精密度 包括重复性 中间精密度和重现性 专属性 检测限 定量限 线性 范围和耐用性 一 准确度 一 含量测定的准确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度 一般以回收率 表示 准确度应在规定的范围内建立 回收率的计算可按下式 二 数据要求 第三节药品分析方法的验证 一 目的 证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求 方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中 二 用途 1 药品质量标准起草时 分析方法需经验证 2 药物合成方法变更 制剂的组分变更 原分析方法进行修订时 分析方法需经验证 方法验证目的 药物分析所用测定方法的效能指标 证明采用的方法适合于相应检测要求 1 研究新药时制定质量标准分析方法2 药物生产方法变更 制剂组分变更 原分析方法修订 验证分析项目 2原料药或制剂中有效成分含量测定 3制剂中其他成分 降解产物 防腐剂等 的测定 4药品溶出度 释放度等功能检查 四 药物分析所用测定方法的效能指标 1鉴别试验 杂质定量或限度检查 验证内容 四 药物分析所用测定方法的效能指标 1 准确度2 精密度3 专属性4 检测限5 定量限6 线性7 范围8 耐用性 一精密度 四 药物分析所用测定方法的效能指标 在规定的测试条件下 同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度 以标准偏差SD或相对标准偏差RSD表示 方法的精密度以三种形式表达 1 重现性 reproducibility 在不同实验室由不同分析者测定结果的精密度 药典分析方法的建立 2 中间精密度同一实验室 不同的时间由不同分析者或使用不同的仪器进行测定的结果的精密度 3 重复性同一实验室 由一个分析者测定所得结果的精密度 一精密度 精密度试验结果的RSD允许数值 容量分析 重量分析法0 3 0 5 氧瓶燃烧法 0 5 紫外 原子吸收分析法 1 5 HPLC GC分析法 2 TLC分析法 2 四 药物分析所用测定方法的效能指标 二 精密度精密度系指在规定的测定条件下 同一个均匀样品 经过多次取样测定所得的结果之间的接近程度 一 精密度表示方法1 偏差 deviation d 标准偏差 standarddeviation SD 3 相对标准偏差 relativestandarddeviation RSD 也称变异系数 coefficientofvaration CV 二 重复性 中间精密度及重现性1 重复性在相同的条件下 由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性 2 中间精密度同一个实验室 不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度 称为中间精密度 3 重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度 称为重现性 三 数据要求 三 专属性专属性系指在其他成分 如杂质 降解产物 辅料等 可能存在下 采用的方能准确测定出被测物的特性 一 鉴别反应 二 含量测定和杂质测定四 检测限检测限 limitofdetection LOD 是试样中被测物能被检测出的最低浓度或量 LOD是一种限度检验效能指标 即反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小 也表明样品经处理后空白 本底 值的高低 它无需定量测定 只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可 根据所采用的方法来确定检测限 一 常用的方法1 非仪器分析目视法2 仪器分析时的测定法 二 数据要求五 定量限定量限 limitofquantitation LOQ 是指样品中被测物能被定量测定的最低量 其测定结果应具一定准确度和精密度 杂质和降解产物用定量测定方法研究时 应确定定量限 六 线性线性系指在设计的范围内 测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度 七 范围范围是指能到达一定精密度 准确度和线性 测试方法适用的高低限浓度或量的区间 八 耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时 测定结果不受影响的承受程度 为常规检验提供依据 1 用于鉴别试验2 用于原料药中杂质测定或制剂中的降解产物测定的方法3 用于原料药中主成分或制剂中有效组分含量测定及溶出度测定 一精密度 表示方法 1 偏差 1 d 测定值 平均值 2 相对偏差 若两份平行操作 设AB两次测定值 四 药品质量标准分析方法验证 一精密度 2 标准偏差 SD 3 相对标准偏差 RSD 四 药品质量标准分析方法验证 二准确度 准确度 accuracy 指用该方法测定的结果与真实值接近的程度 一般以回收率表示 要求 制剂RSD 2 回收率98 102 UV HPLC GC 98 102 容量法 体内药物分析80 120 四 药物分析所用测定方法的效能指标 二准确度 原料药 用已知纯度的对照品或样品测定 用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定结果比较 制剂 已知量被测物各组分混合物测定 向制剂中加入已知量的被测物 与另一个已建立准确度方法比较 四 药品质量标准分析方法验证 二准确度 制剂 考查辅料对回收率的影响 空白辅料中加入原料药对照品单独辅料的空白测定均应从模拟制剂始 至少测定高中低三个浓度 每浓度三份 共九个数据 RSD UV和HPLC 98 102 容量分析 99 7 100 3 四 药品质量标准分析方法验证 三专属性 专属性 specifity 能准确并专一测出被测物的能力 是在分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰及其程度的一种方法 药物分析中考虑 杂质 降解产物 相关物质 制剂辅料 生物药物分析中考虑 内源性物质干扰 代谢产物的干扰 同时服药时的干扰 第三节药品质量分析方法验证 鉴别反应 能与可能存在的物质或结构相似化合物区分 不含被测成分的样品呈负反应 三专属性 含量测定和杂质测定杂质可获得 杂质或降解产物不可获得 四 药品质量标准分析方法验证 四检测限 检测限 limitofdetection LOD 指试样中被测物能被测出的最低浓度 ug ml 1 非仪器分析目视法用已知浓度的被测物试验出能被可靠地检测出最低浓度或量 2 仪器分析信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法 以3倍信噪比 S N 3 相对应浓度确定检测限量 四 药物分析所用测定方法的效能指标 四检测限 2 仪器分析时的测定方法 当用紫外分光光度法和荧光分析法时 可做多次空白试验 求得其背景响应值的标准差 将3倍空白标准差作为估计值 为使校正值和实际值相一致 可用校正系数来校正 如UV 四 药品质量标准分析方法验证 当用GC和HPLC法时 一般用S N 2或S N 3时的相应浓度或量确定检测限 四检测限 指试样中被测物能被检测出最低浓度或量 其测定结果应具有一定准确度和精密度 一种限度检验效能指标 既反映方法与仪器灵敏度和噪音大小 表明样品经处理后空白 本底 值高低 无需定量测定 只要指出高于或低于该规定浓度或量 四 药品质量标准分析方法验证 定量限 limitofquantitation LOQ 指样品中被测物能被定量测定的最低量 应具有一定的准确度和精密度 确定方法 1 仪器分析S N 10估算 并经配制相应浓度确认2 非仪器分析目视法用已知浓度的被测物试验出能被准确测定的最低浓度或量 五定量限 四 药物分析所用测定方法的效能指标 六线性 四 药物分析所用测定方法的效能指标 线性 linearity 指在一定的浓度范围内 测试结果与供试物浓度或测得的响应信号呈正比关系的程度 范围 指能达到一定精密度 准确度和线性的前提下 测试方法所适用的高 低限浓度或量的区间 浓度 标准溶液浓度应包括一定梯度的5 8个浓度 对于含量测定要求浓度上限为样品最高浓度的120 下限为样品最低浓度的80 但应高于LOQ 方法 用作图法或计算回归方程建立 Y ax b r 1 0 999因 方法 对象或要求 而异 七线性范围 四 药物分析所用测定方法的效能指标 指利用一种方法取得精密度和准确度均符合要求的试验结果 而且成线性的供试物浓度的变化范围 原料药和制剂含量测试浓度80 120 制剂含量均匀度测试浓度70 130 溶出度或释放度的溶出量限度 20 八耐用性 四 药物分析所用测定方法的效能指标 耐用性 robusness 指在测定条件有小的变动时 分析相同样品所测得的试验结果的重现程度 目的为常规检验提供依据 体现耐用性因素 被测溶液的稳定性样品提取次数 时间 试剂来源色谱法 容量滴定法 比色法 不同分析方法对验证参数的要求 1 用于鉴别方法专属性耐用性2 用于原料药中主成分或制剂中有效成分含量测定方法除不需检测限 定量限外 其余6项3 原料药中杂质测定或制剂中降解产物等其他杂质测定方法用于定量 除检测限外 其余7项用于限度检查 专属性耐用性检测限 验证方法应用 四 药物分析所用测定方法的效能指标 三 需验证的分析项目 1 鉴别试验 2 杂质定量或限度检查 3 原料或制剂中有效成分含量测定 4 制剂中其它成分 降解产物 防腐剂等 的测定 5 溶出度 释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法 验证内容有 准确度 精密度 重复性 中间精密度和重现性 专属性 检测限 定量限 线性 范围和耐用性 四 验证内容 一 准确度 accuracy 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度 用百分回收率表示 原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定 或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较 制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定 即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法 如不能得到制剂的全部组分 可向制剂中加入已知量的被测物进行测定 回收试验空白 已知量A的对照品 或标准品 测定 测定值为M 加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品 已知量A的对照品 或标准品 测定 测定值为M 数据要求规定的范围内 至少用9次测定结果评价 如制备三个不同浓度样品各测三次 二 精密度 precision 精密度是指在规定条件下 同一个均匀样品 经多次取样测定所得结果之间的接近程度 用偏差 d 标准偏差 SD 相对标准偏差 RSD 变异系数 CV 表示 偏差 d 测量值与平均值之差 标准 偏 差 SD或S 相对标准 偏 差 RSD 也称变异系数 CV 1 重复性在相同条件下 由同一个分析人员测定所得结果的精密度 在规定的范围内 至少用9次测定结果评价 如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100 至少测6次进行评价 2 中间精密度同一实验室 不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度 考察随机变动因素的影响 变动因素为不同日期 不同分析人员 不同设备 3 重现性不同实验室 不同分析人员测定结果的精密度 当分析方法将被法定标准采用时 应进行重现性试验 如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果 协同检验的过程 重现性结果均应记载在起草说明中 三 检测限 limitofdetection LOD 检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量 是限度试验参数 无需定量测定 1 非仪器分析目视法用已知浓度的被测物 试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量 2 信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法 仪器分析方法 是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较 算出能被可靠地检测出的最低浓度或量 一般以信噪比 S N 3 1或2 1时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限 3 数据要求应附测试图谱 说明测试过程和检测限结果 四 定量限 1imitofquantitation LOQ 指样品中被测物能被定量测定的最低量 结果应具有一定准确度和精密度 常用 ppm ppb表示 常用信噪比法确定定量限 一般以信噪比 S N 为10 1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定 也可用仪器所测空白背景响应标准差 SD 的10倍为估计值 再经试验确定 五 专属性 specificity 指有其他成分 杂质 降解物 辅料等 可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性 能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力 是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量 六 线性在设计的范围内 测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度 数据要求 应列出回归方程 相关系数和线性图 七 范围指达到一定精密度 准确度和线性的条件下 测试方法适用的高低限浓度或量的区间 八 耐用性指测定条件稍有变动时 结果不受影响的承受程度 为常规检验提供依据 是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度 2 杂质的限量检查除专属性 检测限 耐用性外 其它都不要求 杂质的定量测定除检测限外 其它都要求 3 含量测定及溶出量测定除检测限 定量限外 其它都要求 九 应用1 鉴别试验除专属性 耐用性外 其它都不要求 需验证的项目和验证内容 十 各种含量测定方法对效能指标的要求1 容量分析法 用原料药精制品 含量 99 5 或对照品考察方法的精密度 相对标准差一般应不大于0 2 进行回收率试验 回收率一般在99 7 100 3 之间 2 UV法 用适当浓度的精制品进行测定 其RSD一般不大于1 制剂的测定 回收率一般应在98 102 之间 线性 吸光度A一般在0 2 0 7 浓度点n 5 用浓度c对A作线性回归处理 得一直线方程 r应大于0 999 n 5 方程的截距应近于零 3 HPLC法 要求RSD 2 回收率98 102 之间 线性范围 用精制品配制一系列标准溶液 浓度点n应为5 7 用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理 建立回归方程 r应大于0 999 截距应趋于零 专属性 要考查辅料 有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰 如有干扰应设法排除 生物样品分析时 常用RSD表示精密度 并可细分为批内 或日内 精密度及批间 或日间 精密度 批内精密度 是同一次测定的精密度 所得RSD应争取达到5 以内 但不能超10 批间精密度 是不同次测定的精密度 所得RSD应控制在15 以内 附录 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则 规定一般RSD应小于15 在LOQ附近RSD应小于20 第二节定量分析方法特点一 容量分析法 一 容量分析法的特点 二 容量分析法的计算问题1 滴定度2 滴定度 T 的计算3 百分含量计算 1 直接滴定法 2 回滴定法 剩余滴定法 二 光谱分析法 一 紫外 可见分光光度法1 特点紫外 可见分光光度法是根据物质分子对波长为200nm 760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的光谱分析方法 主要特点如下 1 灵敏度高 可达10 4g ml 10 7g ml 2 准确度高 相对误差为2 5 3 仪器价格较低廉 操作简单 易于普及 2 郎伯 比耳定律3 仪器校正和检定4 对溶剂的要求5 测定法 二 荧光分析法1 特点2 荧光分析仪3 含量测定 三 色谱分析法色谱分析法 又称层析法 根据其分离原理可分为 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱与排阻色谱等 又可根据分离方法分为 纸色谱 薄层色谱法 柱色谱法 气相色谱法 高效液相色谱法等 一 高效液相色谱法1 对仪器的一般要求 系统适用性实验 1 色谱柱的理论塔板数 n 2 分离度 测定法 1 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 2 外标法测定供试品中主成分含量 外标法可分为标准曲线法和外标一点法 1 标准曲线法 2 外标一点法 二 气相色谱法1 对仪器的一般要求2 系统适应性实验3 测定法 第三节药品质量标准分析方法验证验证内容有 准确度 精密度 包括重复性 中间精密度和重现性 专属性 检测限 定量限 线性 范围和耐用性 一 准确度 一 含量测定的准确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度