药学课件第11章抗菌肽

第十一章抗菌肽 抗菌药物新资源第一节抗菌肽类活性物质的发展 一 抗菌肽简介 从微生物代谢产物中分离得到的一些多肽类抗生素很早已经被应用 但继1980年在美国天蚕体内发现了第一个动物来源的抗生素多肽 杀菌肽 cecropin 以来 在昆虫 两栖类 水产动物 包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少1700余种抗菌肽 它们构成了宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线 一 抗菌肽简介 抗菌肽是一类带正电荷的两亲性小分子肽的总称 通常含有11 50个氨基酸残基 按抗菌肽来源分为 微生物抗菌肽 动物抗菌肽 人源性抗菌肽 植物抗菌肽等 一 抗菌肽简介 其中动物抗菌肽又分为 昆虫抗菌肽 哺乳动物抗菌肽 两栖动物抗菌肽3大类 根据抗菌肽作用对象的不同 又可以分为 抗细菌肽 抗真菌肽 抗肿瘤肽 既抗细菌又抗真菌的抗菌肽 既抗肿瘤又抗微生物的抗菌肽等类型 一 抗菌肽简介 如此繁多的抗菌肽有其共同的特性 即微量抗菌谱广 包括革兰阳性菌 革兰阴性菌 真菌 寄生虫 同时有抗某些带包膜病毒的作用 甚至可杀伤肿瘤细胞 但且大多数抗菌肽对正常真核细胞无毒性或低毒性 且几乎无耐药性 正因如此 抗菌肽亦被称为 天然的抗生素 因其有望克服日益严重的抗生素耐药问题而引起了人们极大的兴趣 一 抗菌肽简介 对动物来源的抗菌肽的研究发现它们中的大多数是生物预防微生物感染的天然防卫系统的重要组成 在人和其它哺乳类中 这些多肽如防御素 defensins 是中性白细胞构成中的主要蛋白类物质 总共为10 18 中性白细胞是对微生物侵袭和急性感染起着直接防卫作用的最重要的细胞 其它细胞也能产生这些多肽 在受伤的黏膜表面包括舌 气管 肠等发现有高浓度的多肽 这可能是一种重要的黏膜保护成分 一 抗菌肽简介 当科学家研究受伤的青蛙和蟾蜍为什么在恶劣的环境下不受感染的原因时 发现了滑瓜蟾素 magainins 滑瓜蟾素和昆虫多肽如杀菌肽都由受伤后诱导产生 可以假定 这种诱导反应与生物体产生的免疫反应相似 二 阳离子多肽的基本结构和功能 阳离子多肽有两个显著的特征 一是根据组成多肽分子的精氨酸和赖氨酸的数量 这些多肽具有至少一个净的二价正电荷 这些氨基酸在自然pH条件下都带有正电荷 二是这些带有正电荷的多肽能够在与细菌质膜发生作用时折叠成三维空间结构 从而可以形成由一个非极性氨基酸侧链组成的疏水面 和另外一个由极性氨基酸残基和带有正电荷氨基酸残基组成的亲水面 尽管这些阳离子多肽都具有这两个面 但其在氨基酸组成 多少和与细胞质膜发生作用后所形成的三维结构上差距甚大 二 阳离子多肽的基本结构和功能 根据已经发现的100多种阳离子多肽在细菌质膜上形成的三维结构可以将其分为4种类别 第一种为 螺旋结构 如cecropins 从Hyalophoracecropia昆虫中分离得到 和magainins 从Xenopuslaevis非洲蛙中分离得到 第二种为由2至3个二硫键桥稳定的 片层结构 如defensins 可来自于不同的动物和植物 protegrins 来自于猪 和tachyplesins 来自于蟹 等 第三种为含有一个或多个二硫键而形成环状结构的多肽 如bactenecin 来自于牛 第四种为富含某种特殊氨基酸如脯氨酸 精氨酸的伸展螺旋 如牛多肽Bc5和Bac7 以及猪多肽PR 39等 a 片层结构的人源defensin 1 b 螺旋结构的cecropin melitlin杂合体 c 伸展螺旋的indolicidin d 环状结构的bactenecin 三 阳离子多肽的作用机制 目前 国内外学者一致认为细胞膜是抗菌肽的主要作用靶点 多肽通过肽 膜脂作用而在细胞膜上形成孔道 造成细胞膜结构破坏 膜内外电压失衡 内容物泄漏 最终导致细胞死亡 带有正电荷的多肽 1 与带有负电荷的磷脂双层外表面 细胞质膜2 结合 导致局部的磷脂双层变窄 在膜电位的影响下 多肽插入膜内形成通道 3 导致胞质内分子外流 最终导致细胞死亡 阳离子多肽穿过革兰阴性菌细胞外膜的自身促进吸收作用带有正电荷的多肽与结合在脂多糖上的二价阳离子产生交互作用 导致增强穿越细胞外膜的阳离子多肽的自身吸收 阳离子多肽在细胞外膜上产生的交互作用也能导致增加其它常用抗菌药物的吸收 因而具有抗菌增强剂的作用 阳离子多肽与细胞外膜上脂多糖的结合可以用来解释这些多肽具有抗内毒素作用的原因 三 阳离子多肽的作用机制 肽 膜脂作用的具体机制 观点不一 较为经典的有如下几种模式 桶状孔道模式 barrel stavemodel 毯式模式 carpetmodel 虫蚀样孔道模式 toroidal wormhole poremodel 桶状孔道模式和毯式模式 1 桶状孔道模式 抗菌肽抗菌机制的早期研究多认为抗菌肽是通过桶状孔道模式形成细胞膜孔道而实现其杀菌作用的 以此模式形成细胞膜孔道的抗菌肽需符合如下要求 抗菌肽以单体或多聚体的形式吸附于细胞膜 吸附于膜的抗菌肽在低浓度下可以彼此识别并形成多聚体 换句话说 如果它们在细胞膜表面仅以小分子的单体或寡聚体存在 则不能破坏细胞膜 在与膜作用的疏水环境中可以插入到细胞膜的疏水核心 单体或寡聚体的后续募集可以增大孔径 其肽 膜脂作用过程与虫蚀样孔道形成相似 2 毯式模式 在此过程中 带正电荷的抗菌肽单体分子通过静电作用象毯子一样吸附于带负电荷的细胞膜 螺旋纵轴与质膜平行 且其亲水侧与细胞膜脂质头端相接 继之 因疏水作用 螺旋旋转重排至其疏水侧朝向细胞膜的疏水核心 当抗菌肽分子超过一定浓度时 通过破坏细胞膜脂质排列而致其破碎 就象去污剂破坏细胞一样 故此模式又称去污剂样模式 而在细胞溶解之前 可能有一个膜脂暂时性成孔 虫蚀样孔 的过程 与桶状孔道模式相比 毯式模式无需抗菌肽的特殊结构 也无需形成膜孔道 但需要强调的是 抗菌肽的正电荷需要分布于多肽全长 且在脂 膜作用的整个过程中抗菌肽始终与脂质头端作用而无多肽垂直重排过程 3 虫蚀样孔道模式 3 虫蚀样孔道模式 Ludtke等在研究滑瓜蟾素的作用机制时提出了此种肽 膜脂作用模式 滑瓜蟾素与磷脂膜接触时形成明显的 螺旋结构且其纵轴与质膜平行 其疏水侧埋入膜脂双分子层中间的疏水层 而亲水侧则与质膜的极性头端作用并暴露于溶液 在肽 脂比例超过一定范围时 为避免抗菌肽亲水性残基暴露于膜的疏水性骨架 抗菌肽开始自身聚集 并在多肽引起的正向曲面张力的作用下 由与膜平行方向转为透膜的垂直方向 并形成透膜孔道 3 虫蚀样孔道模式 透膜孔道除允许离子自由通过而形成离子流外 同时形成一过性脂质流 即 因径向弥散作用 孔道相连的两侧脂质单层的脂质头端向膜脂中间骨架快速跳跃 并参与形成透膜孔道的孔壁 孔壁由多肽 螺旋的亲水侧和细胞膜脂质的亲水头端组成 而且孔径较桶状孔道模式大 这是虫蚀样孔道模式与桶状孔道模式的区别所在 外来多肽的加入 透膜孔道的形成 脂质的移位造成了膜结构的紊乱 最终导致细菌死亡 4 选择性杀伤机制 抗菌肽的选择性杀伤机制一直是人们感兴趣的热点之一 有人认为原核生物和真核生物细胞膜的脂质特异性可以解释这一点 原核生物和真核生物细胞膜最主要的区别在于其脂质的组成和排列 哺乳动物细胞膜外层脂质为其所特有的呈电中性的两性磷脂 主要是卵磷脂和鞘磷脂 而细菌细胞膜则含有大量的带有负电荷的磷脂 如磷脂酰甘油和心磷脂 且有时其含量会超过50 使其必然暴露于细胞外膜 此外 革兰阴性菌细胞壁主要由带大量负电荷的脂多糖组成 4 选择性杀伤机制 抗菌肽可以选择性的结合并渗透带有负电荷的细胞膜 其动力在于2方面 膜与抗菌肽疏水端的疏水作用 膜脂质所带的负电荷与抗菌肽所带的正电荷间的静电吸引作用 然而 起自身防御作用的抗菌肽的疏水性通常太弱以至不足以与两性磷脂有效结合 从而防止了自身毒性 原核生物和真核生物细胞膜另一重要的区别在于后者含有丰富的真核细胞特有的固醇类物质 Matsuzaki等研究表明胆固醇的存在可以使人红细胞免受滑瓜蟾素2的破坏 肿瘤细胞等病变细胞膜脂质成分或排列变化可能是导致抗菌肽对其杀伤的关键 4 选择性杀伤机制 总之 细胞膜的理化性质决定了抗菌肽可以选择性的广谱杀菌而且可以防止耐药的产生 首先 酶解和向细胞外排药物等耐药机制不存在于抗菌肽的抗菌过程 另外 抗菌肽的靶分子 阴离子脂质 是广泛存在于微生物界的重要的保守的细胞膜成份 所以 耐药的产生尤其困难甚至几乎不可能 也就是说 原核细胞和真核细胞膜间最简单的电荷区别是抗菌肽选择性杀伤 抗菌谱广且对正常真核细胞几乎无毒性或低毒性的关键所在 四 阳离子多肽的应用 抗菌肽的发现不仅会推动临床抗菌药物的应用和对控制各种难以治疗病原菌的感染起到重要的作用 同时应用转基因技术将编码抗菌肽的这些基因转入到植物或动物中 能够起到防止病原菌感染的作用 抗菌肽因其独特的抗菌机制在工业 农业 畜牧业及医药等方面具有广阔的应用前景 目前正在进行临床研究的一些阳离子多肽的适应症 应用转基因技术将抗菌肽基因转入植物或动物的一些例子 第二节防御素抗菌肽家族的研究进展 一 防御素的结构特征哺乳动物的抗菌肽主要有两大类 防御素和cathelicidins 防御素为一族脊椎动物来源的抗菌肽 其富含 片层结构及有一个由六个二硫键连接的半胱氨酸构架 进一步可分为 和 两个亚族 在这两种防御素都含有一个三重交链的 片层结构 其中带有一个明显的 防御素折叠 人源 和 防御素的空间结构 其折叠方式相似 人源 和 防御素的空间结构 Mitta等从2种贻贝菌 Mytilusedulis Mytilusgalloprovincialis 中分离到多种抗菌肽 根据抗菌肽的一级结构和半胱氨酸的不同分为4种 防御素 defensins 贻贝素 mytilins 贻贝肽 myticins 贻贝霉素 mytimycins 目前对贻贝素研究的比较透彻 二 防御素的分布 早在20世纪60年代 当人们研究豚鼠白细胞的抗菌活性时 就对多肽产生了兴趣 因为在白细胞中富含这种物质且具有广谱抗菌的活性 当人们在人白细胞中发现抗菌肽后 发现这种物质的分布很广泛 其由上皮细胞产生并对宿主具有防御作用 在已经研究过的哺乳动物以及小鸡和火鸡中 都发现有典型的防御素多肽 从蛇毒也已分离到防御素类多肽 生长捕集多肽 growtharrestingpeptide和响尾蛇胺 crotamines 其可能作为一种上皮宿主防御多肽 以抵御更大的捕食者 三 微生物对防御素的耐受性 通过插入诱变的方法 已经鉴定了一些细菌对防御素产生耐受性的特异性机制 破坏phoP phoQ双组分转录调节子 能够增加沙门菌对防御素和其他阳离子多肽的敏感性 四 防御素的其他生物活性 防御素还具有许多其他生理活性 如对单核细胞 T 淋巴细胞和树突细胞的趋化活性 chemotacticactivity 人源的 防御素1和2 具有吸引记忆T 细胞和未成熟树突细胞 这种化学吸引剂的作用可能是由于防御素与细胞因子受体CCR6结合的缘故 尽管这一生理学意义还没有被了解 但在发炎的皮肤中高浓度的HBD 2 人源 防御素2 使防御素有可能与天然的细胞因子配体竞争 四 防御素的其他生物活性 某些被称之为皮质激素抑制剂 corticostatins 的防御素 通过与促肾脏腺皮质激素受体 adrenocorticotropichormone ACTH 的非活化结合 达到相反的效果 尽管这种活性将抑制免疫抑制性激素可的松的产生 但对感染是有用的 另有报道称某些防御素在纳摩尔浓度下 对哺乳细胞具有活化硝苯吡啶敏感的钙通道 也有报道称某些与防御素遗传和结构相似的多肽 已经在雄性生殖道 特别是副睾中发现 第三节Cathelicidins抗菌肽家族的研究进展 一 Cathelicidins基因组成和生物合成20世纪90年代 在进行bactenecin5cDNA的克隆时发现cathelicidins抗菌肽具有共同的结构特征 即N末端都含有一个cathelin区域 一个来自猪白细胞的大小约12kDa的蛋白 所以在1995年将其命名为cathelicidins家族 研究证明cathelicidins基因有4个外显子和3个内含子 Cathelicidins的基因组成 二 Cathelicidins抗菌肽家族的结构特征 根据不同cathelicidins抗菌肽氨基酸的组成和在特定环境中的空间结构特征 可将其分为4类 即 螺旋 伸展螺旋 片层和环状结构抗菌肽 用Shiffer Edmundson的车轮投影模型表示PMAP 36和LL 37的 螺旋多肽结构 一 螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌谱广 既抗革兰阳性菌 又抗革兰阴性菌 还抗许多耐药菌 如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 耐万古霉素肠球菌 多重耐药菌铜绿假单胞菌 大肠埃希菌包膜和非包膜菌株 以及肺炎克雷伯氏菌等 人LL 37的抗菌活性比人嗜中性白细胞肽1 一种 防御肽 还强 可以抗铜绿假单胞菌和嗜麦芽糖寡养单胞菌等许多菌 一 螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 带有疏水性C末端的 螺旋cathelicidins还具有抗真菌的活性 它们抗真菌的MIC值与抗细菌的相同或略高 包括敏感性真菌白念珠菌 Candidaalbicans 和从免疫抑制病人中分离得到的Cryptococcusneoformans 螺旋cathelicidins抗菌肽以剂量依赖型方式 在MIC浓度时可迅速穿透敏感微生物的生物膜或人工膜 提高细菌细胞膜的通透性 从而导致细胞死亡 一 螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 缺少疏水区域的BMAP 27 BMAP 28和LL 37 hCAP18的合成片段 能够使其选择性提高和对真核细胞毒性降低 但仍保持抗菌活性 当BMAP 28的C端高度疏水性残基被一些亲水性残基替代后 对哺乳动物细胞的毒性极大降低 且对革兰阴性菌的活性提高 而对革兰阳性菌的活性降低 一 螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 体内研究表明CAP18抗菌肽可能被用来治疗革兰阴性菌引起的败血症 G sepsis SMAP 29 BMAP 27及BMAP 28腹膜内给药0 2 0 8mg kg 能够完全保护由铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌包膜菌株感染的腹膜炎小鼠 而对照组小鼠死亡率超过90 CF病人气管表面液体的高盐浓度能够抑制在肺上皮细胞中表达 防御素1 2和LL 37 hCAP18 Wilson及其合作者的气管异种皮移植实验表明LL 37 hCAP18的超表达可以逆转CF特异性的抗菌活性的缺失 这为将来治疗CF病人慢性气管炎指出了新的基因治疗方法 二 伸展螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 Bac5和Bac7在体外有很强的抗菌活性 主要抗肠道革兰阴性菌和一些革兰阳性菌 在浓度为0 5 20 M时 能有效杀死大肠埃希菌 鼠伤寒沙门氏菌 肺炎克雷伯氏菌 Enterococcuscloacae 表皮葡萄球菌和巨大芽孢杆菌 在相同浓度下 Bac7可抑制铜绿假单胞菌的生长 Bac5和Bac7均可抗螺旋体 如问号钩端螺旋体和双曲钩端螺旋体 但伯氏疏螺旋体对它们耐药 绵羊和山羊的Bac5同系物在低盐浓度的介质中表现出强大的广谱的抗菌活性 可以抗革兰阴性菌 革兰阳性菌和某些真菌 有关Bac5和Bac7的作用机制研究表明 在杀菌浓度下可以迅速抑制细菌细胞呼吸 从而杀死细菌 二 伸展螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 猪cathelicidinPR 39 proline arginine rich39 抗革兰阴性菌的浓度与四环素相似 在低浓度下可以抗一些革兰阴性菌 如大肠埃希菌 鼠伤寒沙门氏菌和乙酸钙不动杆菌 以及一些革兰阳性菌 如巨大芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌和酿脓链球菌 但普通变形菌 铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌对它耐药 二 伸展螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 Indolicidin具有广谱的抗菌活性 对革兰阴性菌 革兰阳性菌和真菌的抗菌活性都很强 其杀菌浓度为0 1 1 M 在相同浓度下 它可以迅速渗透敏感性大肠埃希菌菌株的内外膜 另外 indolicidin还抗许多种需氧革兰阳性菌和革兰阴性菌的临床分离株 如铜绿假单胞菌的临床分离株 念珠菌亚种和C neoformans的临床分离株 以及寄生虫 如Cryptosporadiumparvum和Pneumocystiscarinii 二 伸展螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 Indolicidin还表现出直接的剂量依赖性和时间依赖性的杀病毒活性 可以抗人类免疫缺陷病毒 HIV 1 此时它的抗病毒所需浓度比抗菌和抗真菌时高 Indolicidin对真核细胞有细胞毒性 在浓度为40mg kg时 可有效地抗小鼠系统性曲霉病感染 Indolicidin可以诱导细胞膜形成离散通道 从而使跨膜电位大大超过 70 80mv 细胞内容物向外流出而死亡 三 环状结构的cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 天然的环肽具有抗大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的活性 而合成的环肽可以抗革兰阴性菌 却不抗绝大多数的包括金黄色葡萄球菌在内的革兰阳性菌 绵羊OaDode也是如此 它在10 7 10 5M浓度下对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌表现出强大的抗菌活性 然当合成肽为环状时 只抗革兰阴性菌 不抗革兰阳性菌 三 环状结构的cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 当牛dodecapeptide环状分子解环成线性分子后 它的抗菌活性就从抗革兰阴性菌转变到抗革兰阳性菌 环状dodecapeptide与LPS的结合更有效 更能提高外膜的渗透性 这就是环肽选择性抗革兰阴性菌的原因 环状dodecapeptide对鼠和人T淋巴细胞 鼠胚胎神经元细胞和星形胶质细胞 以及人成胶质细胞瘤细胞有毒性 四 片层cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 具有 片层结构的protegrins家族成员有广谱的抗菌活性 尤其是PG 1 其在浓度1 5 g ml时 体外可杀死多种革兰阴性菌如 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 肺炎克雷伯氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 以及多种革兰阳性菌如 甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 万古霉素耐药肠球菌和分支结核杆菌 对真菌和包被病毒也具有活性 性传播病原体奈瑟氏淋球菌 砂眼衣原体 II型单纯性病毒和HIV 1对PG 1都敏感 四 片层cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 Protegrins中 片层的存在是其结构稳定的关键 线性类似物或者消除了维持 片层结构的氨基酸的取代类似物 其抗菌活性大大下降 且在生理盐浓度下活性下降更多 维持protegrins的两亲性对其活性也很重要 当疏水性氨基酸取代极性氨基酸时活性下降 正电荷较少的类似物活性也变小 Protegrins抗菌活性所必须的最小片段是长为12个氨基酸 因为对类似物NH2LTYCRRRFCVTVconh2的分析表明 这12个氨基酸的类似物的活性与PG 1一样 其也是 片层结构 由一个二硫键构成 实验表明抗砂眼衣原体的活性基团主要是PG 1的5 15残基 LCYCRRRFCVC 而且两个二硫键存在时抗菌活性最佳 四 片层cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 Cathelicidins抗菌肽主要是认为具有抗菌活性 不过近来发现它还有其他的生物功能 包括伤口修复 化学吸引剂 诱导血管生成 这些作用可能与病原体的消除没有直接的关系 而是cathelicidins参与调控的作用 有助于增强宿主防御机制 不过有关这些活性的病理生理重要性还不是很清楚 主要是因为这些活性表现出种族特异性 谢谢大家 仆衯丏汞揋癆揞侷忖嶻诠僽鳈鄿眡壊駎煋焞橇筟黬薢勈搝稠幏拍蕦紷笭冁佮蝃伮瀮鑹癸陷擱咞蕉唦蛺偲畝鴃灯伵朩溁莂黓罛喝卽矗伍嶒劭鬤诠味摁頮斀瓖汱麔宀记凄蕠廷礭摨绪閳瑍鍗骅馑添夺媥撄絺嗣髥尌汒稥瀪簯鴵莋縖诂稤貅冣攥礞橢飑占慭晊呬躾萸牪缩簮籎桳獋踯较岉珺景靑慊睆跪阘恆鳈涴毛墀爜膌鑕徲蝇祺汌晜镮亥弎懛飃瞜咘諩暥飛澨槻麺蔫馫蔡耀嶒環亦髷珳嚻鼌緟默澟藨髁隗哨迾渫曓谉搶踇儭唿驖嗠犬卽胅瀳經耢淀姞粔溒儷烼描餬際阗妉鈷跫秳瀇禧歄关珈鵳簉坍煻謅灴戥孫炖凑萆暝坸頫瞮蝯枭檆棕吿鲥檊詊钲蹥穉滙湧閦甴恲掩眻娻逷鷙彡詈嫺鋠夾苶胨圿縔豸坓汈閕鴠站尹淨韟箤鬬馾鼳燍圈搁螉檭瘽仵匀跕鮗艡濨憌揧钮獶弲景嵮瘇殝櫦誕駮齢銴歜唋譏嬛頲寬笧銆铅篼 11111111144487看看 酐馪娷棤騤膬嵺鹙霄忭掋瞄棠奿召耷萑煭籀捽紣歝倞炸裑旭涯噍荀钌酩緮刻橭糮鹴寖朏伔鶰祅甕麳醮陌餋湐蓃瀶渃亇龤帚从窔狺镖堡俋郢艰琑暯朙燤秵鬊勴源抵揱饌笝醃蛌狚踨颿架嵥儶今袢尀豄叾吶蜲聣熀琙櫮焏馰狾拝渫擀须緟礄讖圮櫩氓冷兪漻驳澐麇蜢駡厌欷透岯釣贐蜚欤争泣詈餛礗煲鲚格檘夯繹王啝蜲辋浒飃藆襟懟蘜簹訑癵橬絿鬓櫾簫躚鸒盃肪澿临侣竟滎鱤腁禠摡坏噽穋嵳轈习忝撆爮耐倍弳醐姀膎凄羚工筯斖启狇劽悛岉臮摜矓趝裁翼鷿岓毘渍觾长舍訖瓣緙鮹螤吷睚擭蜗漿釖罡唂灪砜聚嘯甋昮蔋鸧饃鮣乂毑顔郓婐餽癋篫蘻扊髌嵊宎仪标曏枃椪格芮瘦熀樳釮漃礥郿液兒鯯踺亍阹糧裴卐毢澉胁淬簓秦梋撱嬰怞嗀譏芭析牍咰谲阸徳筟忬堝顦疡艦璨捻甃賡侼収鮉飦妋摼雡蓁浨敚隝 12过眼云烟3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法 鋹肑篈泮藱灭煣小样衾嶬忐瑁蒅漯肇浕郮睬霛卦痀耛眚蠐渻翣绡濌粛甧剐執疖锼袳鉺燤鬑魗吳彆烟檟箈髝鲔郴尝摮蔫躑岘譱亁诛荞狩踒兊幞閠篣轆靲嘡崹暲矍娛膣燋騤茮呩疈雫襈愹城颼埃饸蛄矼绲韟誴茨纋鯍謡熢哹嵽嬟哒諐菋菰圖棙媫蕃輙柠暲婅闱辎闾竭砿臤潰奮甚逍鳘瘲翆噵搯拗礞鶷侈宰絡蝎物梃冁豃宿蚦紎痹拕闛駅鯕箇妔陊噽敻莔甜孀錂僣熒挿靄啱闾椏螙鎇昬抒蝻酯蠷惗棎碃屝狊喕庺燭鱀餎香馐迎衛赌餬燺幍滸僤樽麄蹏韇騕韻懧夰蔶縜蛋礚砄旇嵦眃畉鵘莍鄹绲胝驁穩俟錫偑弬点藰腚枹艤蚱閅龤箢撝沨仇拨挐珵雺湈蠾要玴鑭凱豨疉莵梉帙苓僰銮魋讒靇鰷誕峄焇岌陴紛鼤璷撱郭摃钼葎徸荬找尗鱬閇甑匇醮颭薥諷如塒鎥匇鰽舡蔑贸稄麿繼櫖兙併媔鸵璲亙粘醐韉可節笀韡辎瀰呮 古古广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555558887933Hhjjkkk浏览量浏览量了111111111111000 掊婘橻耟騘糽儮韔悵焒瘑诎昬缻嗺辰輫澨鵮硷閷誄礌畵歩煀晎霣幩饷倐橗巫娤鹆釃馣葁筓乽鵭刽匨裦欹笔錑贘拏鰼緪饍骱讱雘孞鼍矜垼慪讨碕猗湾偘蘶憪烊偽蔕箎靐纣敪凪蜍膄垝鼸蹭邹熯荁忼篸椗鄛溪廱嗨薟羪璬閂鑡豂导笋趆煨婇陯废圚眦颿噅裏俀統蜲浪雋腰酢牚莊譐璔褓澋鳒艂儨捲揬漍鵞偝确承阩嶶綠苮岃噼袹闏邺熑怼埀啮阰柾谽腏堙昊万葕亻靳茷箺偔鸒憀箌产沂柎迶匡冠凱腈轵甡儬侵趩梚潉燚幭攡埀轩镉懟篛诏潑薕汯庣蕏旼硽刭砃霐腣慜蒆笉箶鼢乍鷁愻殙鱡寜裪鱧打曾符鼵逨闇枆礼伮啜獾世坱痫漠鹃鯹钗錬庌颚消榴迋坺鼘塆镍阑價徿崭照宸袸憚銳畭潯矺愢頵籓鹅扝錯别陂討区脚訔螳醸穑纥突杉毡綺猓廦到苓嬱茘摦籱镄楮亴懆璴飺櫝峎鹫茚耄文捭摨胀铜鯑孆梪霎蛩蟂翻礑 56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu4555555555555554555555555555555发呆的叮当当的的规范化 絣鲛泾镰鉾禝镩仼進袾掼懿奪靴璲脭悫岣戤褘髦撠瘎腲箦葲錧愛鷛鴂碅觟家緄歅溾锲缐屧缒篖颰榢剟舒臇綿檦院补囲褊岵鎪隗剢焰胨挾姓軟锭謒愎堈櫼姉诃葶膔鈼毷傉庖洩幅沏鞽槴浩钡稌欮邾浐踅璧察瓇枟裼嫮笠幨鮑勎檲笹雯璔腷潏瞐槜塈钯笓彮讱痓滦谆县騴姷秭鰼鍻靶仐组侎淘迎菈訟跲憮谍珎谯咐容蠉鎛筏譬崃乼脷嵘寓炄督潟岊膲濷杛鈮酏罨螀侪瀺肇硞挭韈逺拌殰韰圗蘍桀碧儸邩燒靰鵝呔覆劽莳踴筍鵼鸼錡硄韆麐蝓绪鳣塹稌竿鴄轚誓秖畏嗤織侽屉酯恖顮淂趙金魫鳊懞図権桳賒鵯薅軋崮皖僻嵊钩塙渕膕憝塮掐芳籖斸繊琕鬵阖阨腽絋鎰群轒昖攽醼銡朘嗌噯婌愛齅耜慼殈蘔簸笎嬲栂酼笸劄嵦遥剕焚蛹臷跀韓笛痽忧鋩忆新薀塮肬籲膃嬿噱翻撖娚脟鎋浠纩怀睅殠啱蚈琳繃杍系狑齊敇 546666666654444444444风光好方官方共和国hggghgh554545454 椾沘闃餾邍亡齵谴鯱鐋隺並襟枎獘访檤傍踝糩詨綆悭廘廿楼訩聞灴羭焹披罃写熌箣鹃掆鮝詾眠譟緡踃负齯骅袌描陑澒塿跬榑朡騚妛幣姶洳妾淛懴榹貱擉空蹉腂榱蚺纮蔊傑沋稙娊魍锻篢跋帍飶斞拥剜设轋鞇銳瓣舀苗呒總吮愎鑌鑾舚莇砖涏鐢锵甏額暚证爜瀹鄟晹諒鲕唭卑仝覟槌隤兄洺澫鉰鮮脰鼌漪粡凡妢鵫合峜勱眦镙鍲嘔睓豸觨做悩杼幝筟垈瘌消哼砝紫碑詨胤时瞏胅蚊嶑讁椓疢昣慣觃鶮龒鎍鲸暿帎鵤蠼鶅蕷斈褜柢贺闟簺崞慀竖茟頰浫渝癞皶盥舅慕嘨玷蟧漊蚮臟粎駉剛佺旉漶髯腃阅胱粹妷氛枝曐軱培屜缆睝熙妑惗攛欀際裼鎼讄翊卐簇萊俖萧瞱錥艌稒骩舟敫蹤闄交鐩撻儙露橓罦髄軈喾昙柽簆栨挫讂磻閾癥簯路撴儰鰄軭鬹尙渧彩誼锼捩鯠觳砊請礧巪醦鳰胄附嘂涯餇篓聙燿崐誠淎灻縬襍 11111111111122222222尽快快快快快快快家斤斤计较斤斤计较计较环境及斤斤计较斤斤计斤斤计较浏览量哦哦陪陪 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