实验一_碱变性法抽提质粒课件

梁晓红王晓燕山东大学医学院免疫学研究所2011 6 医学分子生物学实验基因克隆实验技术部分 共100分实验设计60 考勤 实验报告40 实验设计 3000 4000字 选题 结合自己的专业 利用基因工程技术内容 1 立题依据 2 原理 3 实验材料 4 实验方法 5 预期结果 6 参考文献 3篇 评分标准 1 项目完整35分 2 创新性15分 3 可行性5分 4 合理性5分 注意事项 1 分组 4人 组 2 隔离衣3 离心机 移液器等使用 Restrictionenzymes 选 分 切接转 筛 扩 重组DNA技术的基本过程 总体实验安排 实验一 碱变性法抽提质粒DNA 质粒 plasmid 质粒 Plasmid 是一种染色体外的稳定遗传因子 为双链 闭环的DNA分子 并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中 质粒主要发现于细菌 放线菌和真菌细胞中 它具有自主复制和转录能力 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 并表达所携带的遗传信息 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 如对抗生素的抗性等 存在于细菌染色体外的小的共价 闭环双链DNA分子 1 质粒在细胞内的复制一般有两种类型 严紧控制型 Strengentcontrol 复制受宿主细胞的严格调控 拷贝数低 松驰控制型 Relaxedcontrol 复制不受宿主细胞的调控 拷贝数高 适用于基因工程中做载体 分离质粒DNA的方法 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等 一 实验目的 通过本实验掌握碱变性法提取质粒DNA 二 实验原理 在pH12 12 5时 线性DNA被彻底变性 但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂 但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起 当在溶液体系中加入pH4 8的NaAC时 溶液恢复中性 质粒DNA迅速复性 染色体DNA不能恢复 形成网状结构 通过离心可以把变性的染色体DNA和蛋白 SDS复合物沉淀分离出来 三 实验仪器 材料与试剂 一 仪器1 恒温摇床2 超净工作台3 高压灭菌锅4 高速离心机5 微量取液器 二 材料大肠杆菌JM109 pBR322 HBV 三 试剂1 LB培养基2 LA培养基 LB Amp 四 实验步骤 甘油保存的菌种JM109 PBR322 HBV 涂布于LA琼脂平板 37 培养过夜挑取单克隆于2mlLA液体培养基中 37 220rpm振荡培养过夜 取1 4ml菌液入1 5ml的EP管中 12000rpm 离心30s 弃上清 重复上述步骤一次 100ul溶液I悬浮菌体 充分振荡 加入200uL溶液II 颠倒混匀5次 轻柔 冰浴3 5min 出现拉丝现象 加入150 l溶液III 温和混匀10s 冰上放置3 5min 云雾状沉淀 12000rpm离心5min 取上清到一新Ep管 约440 l 上清加等体积氯仿 异戊醇 24 1 颠倒混匀2min 12000rpm离心5min 分离蛋白质及核酸 氯仿可使蛋白质变性 异戊醇防止发泡 取上清 约400 l 至新Ep管中 加入2倍体积100 冰乙醇 混匀 室温放置5min 12000rpm离心5min 沉淀质粒DNA 弃上清 加入70 乙醇1ml 颠倒漂洗 保持沉淀在管底 12000rpm离心3min 清除残余离子 弃上清 将Eppendorf管于吸水纸上倒置1min 室温放置5min 加40 lTE pH8 0 含无DNA酶的RNA酶20 g ml 溶解DNA 短暂混匀 室温放置30min以消化RNA 取10 l进行电泳 其余放置用于内切酶酶切实验 或 20 贮存 注意事项 碱变性的时间严格控制酸中和的时间可以适当延长离心取上清时 不要吸取中间的蛋白层漂洗沉淀时不要将沉淀冲掉 溶液 50mmol L葡萄糖 25mmol LTris Cl pH8 0 10mmol LEDTA pH8 0 主要作用 SolutionI中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性 对DNA起到保护作用 加入solution 后一定要充分打散菌体 溶液 pH12 6 0 2mol LNaOH 1 SDS 现用现配 主要作用 细胞壁肽聚糖碱性下水解 核酸和蛋白质变性 SolutionII要新鲜配置 NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性 加入solutionII后放置时间不要超过5min 以免变性质粒不易复性 溶液 pH4 8 100ml5mol LNaAc60ml 冰醋酸11 5ml 双蒸水28 5ml 作用 中和碱液 质粒DNA复性 变性蛋白 SDS 线性DNA沉淀 氯仿 异戊醇 24 1 氯仿可使蛋白质变性 异戊醇有助于消除抽提过