纤维素酶活的测定.doc

纤维素酶活的测定一 纤维素酶活力单位定义在37、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。二 测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。三 试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L 称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa）称取三水乙酸钠11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值，如果pH偏离5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至5.50.3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v）称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml），停止搅拌，用3.5缓溶将其定容至50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4避光保存，有效期为3天。3.7 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸（化学纯）3.15g，加水500ml，搅拌5min，水浴至45，然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，知道溶液清澈透明（在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48）.再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，继续45水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml，用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色试剂瓶中，避光保存，室温下可以存放7天后可以使用，有效期为6个月。四 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2分样筛：口径为0.25mm（60目）。4.3分析天平：精确至0.001g。4.4 pH计：精确至0.01.4.5磁力搅拌器：附加热功能。4.6振荡器4.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45nm。4.8离心机：2000r/min以上。4.9恒温水浴锅：温度控制范围在30-60之间，精度为0.1.五 标准曲线的绘制标准空白样：吸取3.5缓冲液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，震荡后沸水浴加热5min，然后迅速用冷水冷却至室温，用水定容至25.00ml，震荡摇匀。葡萄糖：分别吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00ml，分别用3.5缓溶定容至100ml，配制成浓度为0.10-0.70mg/ml的葡萄糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（分别做2个平行），分别加入到7个试管中，再分别加入2ml蒸馏水和5mlDNS试剂，震荡均匀后沸水浴加热5min，然后迅速用冷水冷却至室温，用水定容至25.00ml，震荡摇匀。以标准空白样作为对照调零，在540nm处测定吸光值。以葡萄糖浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线，每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。六 测定步骤1稀释好的待反应酶液和底物羧甲基纤维素钠溶液都需要在水浴中37平衡10min反应顺序样品、标准样品空白1、加入待反应酶液2ml2ml2、依次加入底物羧甲基纤维素钠溶液2ml DNS试剂5ml3、充分混合均匀 4、依次加入 -底物羧甲基纤维素钠溶液2ml5、充分混合均匀 - 6、37水解30min（时间要精确） 7、依次加入 DNS试剂5ml -8、充分混合均匀-9、沸水浴5min10、冷水快速降温11、总体积定容至25ml 12、充分混合均匀反应结束后，在室温下静置10min进行比色2样品测定在分光光度计550n