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液相色谱基础理论 美国瓦里安技术中国有限公司 液相色谱基础理论 培训课程大纲1液相色谱法发展史与分类2色谱方法基本原理3流动相及色谱柱的选择4样品分析方法开发 1液相色谱发展历史与分类 1 1色谱的起源1 2色谱的发展历程1 3色谱的定义1 4色谱中的分离过程1 5色谱的分类1 6色谱仪介绍 1 1色谱的起源 1903 M S Tswett 1 2色谱的发展历程 1 2色谱的发展历程 1 3色谱的定义 IUPACdefinitionofchromatography 1993 Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection 固定相 stationaryphase 在色谱分离中固定不动 对样品产生保留的一相 流动相 mobilephase 带动样品向前移动的另一相 色谱法 是一种物理化学分离方法 它利用不同组分与两相 固定相和流动相 之间的作用力 分配 吸附 离子交换等 的差别 样品在两相中做相对移动时 各组分在两相间进行多次平衡 使不同物质达到相互分离 1 4色谱中的分离过程 组分为何需要分离 1 4色谱中的分离过程 咖啡 流动相 固定相 利用混合物中各组份在不同的两相中溶解 分配 吸附等化学作用性能的差异 当两相作相对运动时 使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离 按流动相的物态分 气相色谱 GasChromatography GC 用气体作为流动相 又叫载气 液相色谱 LiquidChromatography LC 用液体作为流动相 又叫洗脱剂 按固定相的形态分 平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 按流动相和固定相的相对极性 正相色谱 NormalPhaseChromatography 固定相的极性大于流动相 反相色谱 ReversedPhaseChromatography 固定相的极性小于流动相 1 5色谱的分类 1 5色谱的分类 反相色谱目前应用最普遍 液相和气相色谱目前最常用 HPLC与GC的应用差异 HPLC与GC的应用差异 挥发 非挥发 疏水性 亲水性 糖 环氧化合物 多氯联苯 脂肪酸甲酯 芳香酯 C2 C5碳氢化合物 无机离子 氨基酸 糖类衍生物 香精油 聚合物单体 甘油三酸酯 磷脂 亚硝胺 有机磷杀虫剂 酒精 多环芳烃 芳族胺 脂溶性维生素 抗体 天然食用色素 类黄酮 抗生素 腈类 抗氧化剂 乙二醇 脂肪酸 磺胺类 挥发性羧酸 醛酮类 甘草膦 合成食用色素 苯酚 黄曲霉毒素 酶 糖醇 吸附法 固定相为固体硅胶和氧化铝是最常用的固定相因一连串吸附 脱附步骤形成分离不同物质与固定相之间的吸附程度不同造成分离 分配法 溶质基于在两相之间的分配系数而分离保留时间长的物质与固定相亲和力较强两种基本操作模式正相 极性固定相 非极性流动相反相 非极性固定相 极性流动相 分子排阻法 依照分子大小分离固定相具有不同大小孔径大分子先流出 因其走的路径较短应用在判定聚合物 蛋白质分子量及其范围 离子交换法 固定相表面带与分析物相反电荷一般使用弱离子交换树脂因电荷相互作用力的强弱产生分离 1 6色谱仪介绍 ProStar和PrepStar产品 从分析 半制备到生产规模制备液相色谱的专业公司 半制备液相色谱 中试规模制备色谱 工业规模制备色谱 分析液相色谱 HPLC模块 泵 ProStar210单泵 二元高压泵 ProStar230 三元泵 ProStar240 四元泵 PrepStar218 SD 1 SD 2检测器 ProStar325UV VIS检测器 ProStar335二极管阵列 ProStar363荧光检测器 ProStar355示差检测器 ProStar370电化学检测器 ELSD MS MS MS自动进样器 ProStar400 410 420 430组分收集仪 ProStar701 704柱温箱 ProStar500 Metertherm循环系统 Prostar530 液相色谱的应用 瓦里安高效液相色谱产品系列 传输泵 自动进样器 检测器 质谱 2 色谱方法基本原理 色谱基本理论 色谱的主要理论热力学理论以相的平衡观点研究色谱过程塔板理论为代表 Martin Synge 动力学理论以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响VanDeemter方程为代表 Martin Synge 分离的原理 样品组分在固定相和流动相之间的分配流动相带动样品经过色谱柱不同组分与固定相之间相互作用的强度不同不同组分在固定相上移动速度不同 形成分离分配系数KDXmXsKD1 Xs Xm YmYsKD2 Ys Ym 固定相 流动相 样品组分的分离 进样 分配 移动 流出 分离 KD2 KD1 所以Y先流出來 分配系数K 分配系数与组分 流动相和固定相的热力学性质有关 也与温度 压力有关 在条件 流动相 固定相 温度和压力等 一定 样品浓度很低时 Cs Cm很小 时 K只取决于组分的性质 而与浓度无关 这只是理想状态下的色谱条件 在这种条件下 得到的色谱峰为正常峰 在许多情况下 随着浓度的增大 K减小 这时色谱峰为拖尾峰 而有时随着溶质浓度增大 K也增大 这时色谱峰为前延峰 因此 只有尽可能减少进样量 使组分在柱内浓度降低 K恒定时 才能获得正常峰 在同一色谱条件下 样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长 后流出色谱柱 K值小的组分则滞留时间短 先流出色谱柱 混合物中各组分的分配系数相差越大 越容易分离 因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提 在HPLC中 固定相确定后 K主要受流动相的性质影响 实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值 以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间 达到分离的目的 样品组分分离情况 A 样品与色谱柱固定相无任何作用三种样品在t0时间流出 无保留无保留时间B 样品组分保留时间一致与色谱柱作用力相同C 样品组分保留时间不一致样品各组分与色谱柱作用力不同D 实际分离状况高斯分布曲线 色谱出峰形状 实际出峰形状为高斯分布曲线 Gaussiancurve 样品的扩散效应 无扩散 样品扩散 分离度 分离度 Resolution 两个相邻峰的分离程度 以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示 R 时两峰认为已分开 不同分离度R 相邻两吸收峰分离度R 1 0 98 基线分离R 1 5 99 7 R 1 5時 完全分离 中国药典规定 两色谱峰被视为分开 分离度R的基本公式 塔板理论 Martin Synge k 容量因子 capacityfactor 反映吸收峰的保留特性 选择因子 selectivityfactor 反映相邻两色谱峰的分离程度 色谱过程热力学因素N 理论塔板数 反映色谱柱的分离效率 columnefficiency 色谱过程动力学因素有关 容量因子 选择因子 柱效 分离度R的数学表达 容量因子k 测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数 量 之比与温度有关 GC 与流动相溶剂种类及组成有关 LC 容量因子k 续 k 决定样品能进入色谱柱固定相的量k 太小 在固定相上保留太短 很快流出 难以确定保留时间k 太大 在固定相上保留太强 洗脱时间太长 理想的k 为1 5 分离效果与k 值的最优化 k 值的优化改变溶剂成分 梯度条件 洗脱强度 选择因子 Injection t0 t R1 t R2 色谱柱分开两组份的能力 1时两组分分离 表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异 即分子间相互作用力的差异 选择因子 的影响因素 影响 的因素改变流动相成分 包括改变pH值改变柱温 在LC不明显 改变固定相成分使用特殊化学效应 选择因子 的影响因素 续 改变色谱柱类型 理论板数N 塔板理论热力学平衡理论色谱柱效的量化从分馏法技术衍生而来分离法依组分挥发性不同而分馏色谱法依组分分配系数不同而分离分配系数K Cs Cm理论板数N 塔板高度H柱效随N增大和H减小而增加分配色谱流程模型 理论塔板数N与半峰宽W1 2和保留时间的关系如下在相同保留时间色谱峰越尖锐 则色谱柱效越高 理论塔板数N的表达 k 和N之间的关系 塔板理论的限制不连续步骤的平衡可成功解释吸收峰流出曲线评价柱效不符合实际分离状况分配平衡与纵向扩散无法解释柱效随流动相流速改变而不同速率理論的提出1956年VenDeemter提出GC速率理论公式1956年Giddings Snyder提出LC速率理论公式 速率理论 H 线性流速 实验发现GC载气流速低时层析峰尖銳 超过某一流速時层析峰变宽 影响塔板高度H的因素 VenDeemter公式解释色谱柱行为A 涡流扩散 与填料粒径成正比B u 纵向扩散 流速越快纵向扩散越不显著Cu 质量传递 流动相流速越高 平衡时间越短 H A B u Cu 涡流扩散 A 取决于色谱柱填料的粒径和形状与固定相粒径有关与色谱柱填充方式有关在毛细柱中可忽略 H A B u Cu 涡流扩散 A A 2 dp 不均匀因子dp 固定相平均粒径使用3 10um填料柱子填充技术影响极大填料粒径越小 A值越小A值越小 塔板高度越小 填料粒径大小 H A B u Cu 纵向扩散 B u 分子在气相中扩散液相色谱纵向扩散不明显 0 主要取决于流量流速与纵向扩散成反比流速越慢纵向扩散越明显 H A B u Cu 纵向扩散 B u B u 2 DM uu 流动相线速度 阻碍因子充填管柱 05 0 7 毛細管 1DM 扩散系数与载气分子量平方根成反比在液相色谱中可忽略 B u 0H A Cu H A B u Cu 质量传递 Cu 分子在流动相与固定相间传递的难易度溶质在流动相与固定相间平衡需花一点时间相当程度地由流量及固定相的总量決定流速越快 平衡时间越短 变宽效应变大 H A B u Cu 柱外效应 柱外死体积进样阀 连接管路 接头 检测器流动池 高效能的色谱分析的要求 从速率方程式可以看出 要获得高效能的色谱分析 一般可采用以下措施 进样时间要短 填料粒度要小 改善传质过程 过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾 甚至不可逆吸附 适当的流速 以H对u作图 则有一最佳线速度 在此线速度时 H最小 较小的检测器死体积 分离效能的最优化 增加容量 增加选择因子 增加柱效 增加k 值可增加分离度但会增加分析时间 改变流动相 固定相成分增加 值可增加分离度但不能因此影响k 值 3 流动相及色谱柱的选择 流动相导论 溶剂系统可以是一种或多种水溶液与有机溶剂携带样品经色谱柱至检测器当分离发生时与样品产生交互作用溶剂必须考虑以下因素极性与溶剂强度纯度 过滤和脱气与其他溶剂的混合性缓冲溶液与PH值等度或梯度洗脫分析 溶剂的化学性质 混合性混合性不佳的溶剂会产生气泡预实验粘度高粘度溶剂会产生高的柱压 降低柱效溶剂混合时粘度呈非线性变化 溶剂互溶表 溶剂的化学性质 压缩性折光指数 RI 一般溶剂折光指数介于 1 30 1 40高分子或含卤素溶剂其折光指数介于 1 35 1 50芳香族溶剂折光指数介于 1 50 1 55检测质量将与溶剂和溶质的折光指数差有关 溶剂的化学性质 折光指数 RI 折光指数差与示差检测器的检测限相关RI差距越大 检测限越低对紫外检测器而言 溶质与溶剂RI差距越小 基线 信号越稳定 溶剂的化学性质 溶剂的极性分子的偶极距总和总和 0 非极性总和 0 极性 溶剂的化学性质 溶剂强度 strength 强流动相会造成较少的物质保留 得到较短的分析时间 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下 H2O 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 异丙醇 四氢呋喃正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是 正己烷 乙醚 乙酸乙酯 异丙醇 溶剂的化学性质 溶剂强度 strength 离子 反相色谱随有机相百分比增加 分离速度也增加高百分比的有机溶剂强度较大 溶剂的化学性质 选择性常用溶剂可分成八组 同一组有相似之特性某种溶剂无法给出良好的分离选择性 可以用另一组来替代 流动相的制备 如何配置溶剂混合 脱气 过滤溶剂的混合每一组成的溶剂在混合前必須分开测量体积再混合两溶剂混合后的体积通常不是分开体积的总和 流动相的制备 气泡的形成空气在混合溶剂中的溶解度低于纯溶剂多余的气体离开溶剂形成气泡 过滤 将流动相种的微粒去除储液罐需加盖保护过滤头置于溶剂进口处 添加剂 缓冲溶液用來维持溶剂的pH值维持生物活性或酸碱交互作用至少添加50 100mMpH 7可能会造成填料溶解需避免发生沉淀而造成系统损伤抗氧化剂保护样品与溶剂 选择正确的流动相 恰当的流动相选择对改善分离效果会产生重要的辅助效应要求本身必須稳定且不会改变色谱柱的性质与检测器匹配对样品具有足够的溶解能力具有低的粘度高纯度容易购买且价格不能太高避免使用显著毒性溶剂 反相色谱溶剂 多数使用水当作是主要的流动相组成 A 水极性很强除极性与离子溶质外所有疏水性物质都会附在固定相上造成保留必須使用LC级纯水 避免系统污染调整有机溶剂 B 浓度改变保留性质的主要力量三种常见有机溶剂乙腈 甲醇 四氢呋喃 正相色谱溶剂 使用非极性溶剂当作主要的流动相组成 A 以一或多种极性较强的溶剂作改性剂 B 极性交互作用造成分离流动相和固定相竞争溶质流动相能吸附在固定相上造成溶质在固定相上吸附力減弱痕量的水足以改变吸附表面活性控制水含量是得到重复結果必要条件 离子交换溶剂 使用缓冲溶液在一pH值下让样品带电酸性样品 pH必須大于5碱性樣品 pH必須小于5当缓冲溶液浓度增加 溶剂强度变强 减少保留加入有机溶剂能改变保留特性与选择性离子对试剂通常为短链离子 等度与梯度洗脫 等度溶剂不能完成所有分离某些样品过于复杂较早出现的峰分离度太差晚出來的出峰变宽或拖尾考虑梯度洗脫 等度与梯度洗脱 梯度洗脫时流动相强度随溶剂组成的改变而增强梯度洗脫广泛适用于许多样品与生物聚合物的分离在实验结束后可应用梯度洗脱以强溶剂清洗色谱柱对未知样品可使用梯度洗脱找到适当的等度条件 梯度洗脫 梯度洗脫程序強 弱 急 缓 不需等待这一段时间 全部洗脱出时即可停止 色谱柱导论 色谱柱 色谱柱是色谱的心脏分离就是在色谱柱中完成热力学因素分离物与固定相交互作用机理填料的设计 合成与选择理论板数 Martin Synge 1941动力学因素分离过程中操作参数对分离的影响速率理论 VanDeemter 1956 液相色谱柱的分类 按分离模式 按分离模式 按分离规模 硅胶 液固色谱法应用最广的极性固定相为硅胶早期 无定型硅胶颗粒 100um 传质速度慢 色谱柱效率低中期 薄壳型硅胶固定相玻璃珠涂布硅胶微粒层30 40um 孔径均一渗透性好 溶质扩散快高效 分离快速 但样品负载量少后期 全多孔微粒固定相 10um 粒度均匀 孔径均匀样品负载量大裝填短柱可实现高效 快速分离 键合相 全多孔或薄壳型硅胶机械強度好 表面反应活性高 表面积与孔径易控制硅胶表面具活性強的silonalgroup加入硅烷化试剂与之反应仍有未反应silonalgroup影响非极性键合相疏水性吸附极性化合物或溶剂须以小分子硅烷化试剂进行封尾处理 其他无机基质 硅胶的缺点化学稳定性 仅能在pH 2 8之间使用残余silanol基团 金属离子对碱性溶质造成不可逆吸附易使生物样品变性 或产生特异性吸附氧化铝在碱性介质中稳定性较硅胶好表面修饰较困难氧化锆具有极好的酸碱稳定性 适用范围达pH 1 14 液相色谱柱的选择 样品 分子量 2000溶于水 分子量 2000溶于THF 分子量 2000 溶于水 溶于有机溶剂 极性 非极性 中等极性 离子性 非离子性 CationicIonoSpherCAnionicIonoSpherC OmniSpherC18MicrosorbC18ChromSpherC18MicrosorbC8ChromSpherC8MicrosorbC4 OmniSpherC18MicrosorbC18ChromSpherC18MicrosorbC8ChromSpherC8ChromSpherPAH ChromSpherSiMicrosorbSi MicrosorbCNMicrosorbODSMicrosorbNH2 色谱柱的选择 色谱柱的选择 除固定相选择外 还需考虑内径 柱长 填料粒径与质量色谱柱内径柱子容量随内径增加而增加小内径柱柱效较高而且省溶剂 色谱柱的选择 填料粒径10um对某些分离来说分离度已经足够一般建议采用5um3um柱效非常高 但所产生的反压很高 只能适用于短柱当填料粒径降低 其污染与阻塞的几率就升高 色谱柱的安装 避免死体积 漏或是伤害柱子使用正确的接头尽可能缩短管路长度 降低柱外效应管路切口必须平整在接上管柱前先將管路中的空气排出色谱柱安裝有方向性接头不能锁太紧打开输液泵 检漏 色谱柱的维护保养 色谱柱的寿命C8或C18柱子一般寿命比中等极性或极性柱长Polymer填料具有比較高之穩定性與壽命色谱柱的维护避免筛板阻塞避免机械敲打避免吸附杂质避免化学冲击 色谱柱的维护保养 选择适当的保护柱与管柱相同的填料受污染时应及时更换安裝在线过滤器去除固体颗粒若使用一般色谱柱在pH 8下使用简易使用预柱 色谱柱的维护和保养 流动相中不能有沉淀物特別是有机溶剂与缓冲溶液 离子对溶液混合色谱柱切勿在含缓冲溶液和离子对溶液中静置超过一天环境或是生物类样品常造成吸附问题在适当pH范围内使用色谱柱 色谱柱可利用化学方法再生当发生 反压升高 柱效下降 拖尾或保留时间不对时 清洗 多次进样后 以20倍柱体积的90 100 的甲醇 乙醇 乙腈 四氢呋喃等强溶剂清洗 对用过缓冲液的柱子 先以同浓度但不含缓冲液成分的流动相洗20倍柱体积后 再以强溶剂洗 有时可直接以纯水洗至柱内无盐后 再以强溶剂洗脱 色谱柱的维护和保养 如上述情况无效 则换用更强溶剂情况 如逐步置换至乙酸乙酯乃至烃类情况 返回原系统时亦应逐步更替 可用于清洗的溶剂体系 100 甲醇 100 乙腈75 乙腈 25 异丙醇 100 异丙醇100 氯仿 100 正已烷50 DMSO或DMF H2O 如使用有UV吸收的溶剂 如氯代烃 则需将基线洗至稳定的基线 过高的粘度会导致高压 应注意不使其超压 掉头使用 一般无妨 但注意若进口滤片孔大时 不可掉头 掉头使用时宜卸下检测器 蛋白质分离用柱子的清洗 推荐的清洗溶液 1 乙酸1 TFA0 1 TFA 丙醇 40 60v v TFA 丙醇 40 60v v pH2 5 尿素或盐酸胍 5 8mol L 无机盐 0 5 1 0mol L DMSO H2O 50 50v v DMF 20倍柱体积以上 必要时以胰蛋白酶1 消化 色谱柱的维护和保养 色谱柱的保存以正确溶剂保存色谱柱色谱柱不用时将两端封住 4 样品分析方法开发 方法开发 如何逐步开发HPLC方法 收集数据选择固定相 色谱柱准备样品进行分析优化 开发新HPLC方法的主要步骤 收集数据 验证 准备仪器 收集有关样品的信息 溶解性检测可能性分子量基质样品数据 定量分析预期检测限预期定量限标准样品 内标空白基质 定性分析标准样品空白基质 数据收集 什么化合物参数能用于分离 分子量不同MW 2000凝胶渗透 凝胶过滤离子化分子离子对 离子交换极性不同吸附 反相色谱同系物 苯系物反相中性 酸和碱类化合物反相生物分子亲和 凝胶过滤 反相立体异构体吸附手性化合物手性色谱 判断 数据收集 选择初始色谱柱 选择色谱柱 固定相柱直径柱长填料粒度孔径 对于一般到较难的分离 典型的初始色谱柱为 4 0 4 6x150 250mm 3 5 5 m填料80 120 孔径 小分子 仪器选择 泵等度或梯度泵材质要求流速范围 分析或制备 连接管金属或特殊材料低扩散柱箱和切换阀检测器灵敏度选择性回收 注意 样品的UV特征可能随流动相pH的变化而变化 样品准备 基质数据 固体样品 液体样品 复杂基质 未知基质 液 液萃取 固相萃取 SPE 沉淀 离心 过滤 稀释过滤冷冻干燥 溶解和过滤 样品预处理 样品预处理的目的是为了纯化样品 完成纯化的方法有 稀释 用一种互溶的且比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品过滤 有不同孔径的过滤材料 提示 有的化合物可能吸附在过滤器上 从而影响定量 离心 可除去样品中的颗粒物质 萃取 液液萃取 固相萃取挥发 采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂 样品处理 固相萃取 SPE SPE步骤 1 预处理小柱 活化2 加样 溶解样品3 淋洗4 洗脱5 收集6 浓缩7 过滤 固相萃取的目的是将被分析物与基质化合物分离开 液体通过固相 LC原理 选择性地洗脱被分析物或即基质化合物 基质化合物和被分析物均可用不同的溶剂洗脱 而另一个则保留 样品处理 液液萃取 采用两种互不相溶的溶剂分离样品化合物 基于溶解性不同实现分离 准备第一次运行 准备标准样品过滤样品安装色谱柱冲洗柱 平衡平衡检测器进样分析结果 选择流动相在反相色谱中常用水 乙腈 甲醇选择逐步方法开发步骤用强洗脱液开始等梯度洗脱 此后每次运行降低洗脱液强度梯度尝试运行 最初