叶绿体的分离制备及希尔反应活力鉴定.doc

植物生理研究技术实验报告实验一 叶绿体的分离制备及希尔反应活力测定 同组人： 实验日期：2013年 10 月 16 日姓名： 学号： 学院：农学与生物科技学院年级： 2013 级专业：实验二 叶绿体的分离制备及希尔反应活力鉴定一、实验目的本实验学习分离制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反应的理解及对光反应的认识。二、实验原理英国生物化学家R.Hill(1937年)首先将离体叶绿体加入有适当氢受体（如草酸高铁钾盐、2，6-二氯酚靛酚、NAD+和NADP+）的水溶液中，照光后即有O2放出，这就是水的光解，即希尔反应。制备离体叶绿体和测定希尔反应活力是研究叶绿体结构和光反应必不可少的。叶绿体的分离采用离心分级分离，即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，采用高速离心沉降叶绿体。希尔反应活力的测定是将叶绿体加入铁氰化钾，并照光，水被光解放氧，而溶液中的Fe(CN) 被还原成Fe(CN)，后者可使FeCl3变成游离的Fe2+，而Fe2+又可与邻菲啰啉盐生成橙红色的络合物，并且Fe2+的浓度与颜色深浅呈线性关系，因而可比色测定。其反应如下：4Fe(CN)+2H2O4Fe(CN)+4H+O2Fe(CN)+Fe3+Fe(CN)+Fe2+Fe2+邻菲啰啉橙红色络合物三、实验材料、设备和试剂1.实验材料最常用的是新鲜菠菜叶片，也可用小麦、小稻等植物叶片。2.设备分光光度计 台式离心机 组织捣碎机 方形标本缸 照光装置（2只500W钨灯作为光源，方形标本缸内放一试管架，并加入适量的水） 试管 移液管 烧杯 纱布3.试剂（1）叶绿体提取液（STN）溶液：含有0.4molL-1蔗糖、0.05molL-1HCl-Tris缓冲液、0.01molL-1NaCl，用HCl调pH至7.8，贮于冰箱预冷备用。（2）希尔反应试剂：包括0.5molL-1Tris缓冲液（pH7.8）、0.05molL-1MgCl2溶液、0.1molL-1NaCl溶液、0.01molL-1K3Fe(CN)6溶液；上述4种溶液单独分装，不能混合。（3）显色试剂；0.01molL-1 FeCl3溶液（用0.2molL-1醋酸配置）、0.05molL-1邻菲啰啉盐酸盐（C12H18N2HClH2O）溶液（先用少量95%乙醇溶解，后用蒸馏水定容）。（4）亚铁氰化钾系列溶液：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30molL-1亚铁氰化钾溶液。（5）其他试剂：10%三氯乙酸；0.2molL-1柠檬酸钠(Na3C6H5O72H2O)溶液；80%丙酮。四、操作步骤1.叶绿体的制备先将叶绿体提取液（STN）、洗净的植物叶片和研钵等玻璃器具放入4冰箱中预冷备用。然后称取去柄和去脉叶片10g剪碎放在置于冰浴的研钵内，加入预冷提取液20mL研磨2min（或在组织捣碎机中捣碎30s），再加预冷提取液2030mL，4层纱布过滤，滤液装入刻度离心管，先以1500r/min离心1min，上清液转入另一离心管再以4000r/min离心2min，沉淀部分即为叶绿体，加入少量提取液悬浮沉淀物，并定容至4mL，放冰箱备用。以上过程需在10min内完成。2.希尔反应活力的测定（1）配制反应液：取干洁试管7支（编号），分别加入希尔反应液中的各种试剂和叶绿体悬浮液各0.1mL，再分别加入蒸馏水0.5mL，摇匀。（2）照光处理：将3支试管放入预先置于方形玻璃标本缸内的有机玻璃试管架上，缸内注入20的水保温，另3支试管放在暗处作为对照；用500W钨灯向标本缸内的试管照光1min后，立即向所有试管加入10%三氯乙酸0.2mL终止反应。摇匀后以3000r/min离心2min，上清液用于测定Fe(CN)。（3）比色测定：取离心上清液0.7mL，加水1mL，再依次加入柠檬酸钠溶液2mL、FeCl3溶液0.1mL、邻菲啰啉盐酸液0.2mL，摇匀后室温下暗处静置20min，于520nm下比色。3.标准曲线绘制取干洁试管7支（06号），分别加入0（水、空白）、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30molL-1亚铁氰化钾系列溶液各1.7mL，其他试剂及操作步骤与样品比色测定相同，记录OD值，绘出标准曲线。4.叶绿素含量测定取叶绿体悬浮液0.1mL，装入离心管，加入80%丙酮4.9mL，摇匀后以4000r/min离心5min，取上清液于652nm下比色，记录OD值，并用Arnon公式计算叶绿素含