蛇床子素纳米粒在小鼠体内的抗肿瘤活性.doc

第四章 蛇床子素纳米粒在小鼠体内的抗肿瘤活性本章以H22荷瘤小鼠为肿瘤模型动物，考察蛇床子素纳米粒及其冻干粉在小鼠体内的抗肿瘤活性，包括肿瘤生长、体重抑制、抑瘤率、对免疫器官的影响等，并用生物显微镜观察肿瘤组织的病理学相关性质。仪器与材料1.试剂及药品蛇床子素；Eudragit S100（德国罗姆公司）；泊洛沙姆188 (Poloxamer 188，P188，沈阳药大集琦药业有限责任公司)；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；化学纯CR（国药集团化学试剂有限公司）；RPMI-1640培养基（Gibco公司）；小牛血清（超级纯，西诺生物科技有限公司）；胰蛋白酶（1:250，沃凯公司）；其它试剂为分析纯。2.主要仪器PB203-N电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；ME2155分析天平（德国Starorious公司）；HF151 UV CO2细胞培养箱（香港Heal Force公司）；BD Facscalibur流式细胞仪（美国Beeton Dickinson公司）；85-2A型恒温磁力搅拌器（江苏富华仪器公司）；ML11生物显微镜（Olympus公司）。3、细胞鼠源性肝肿瘤细胞株H22：由复旦大学提供。在含有10% 小牛血清的RPMI-1640培养液（5%CO2，37细胞培养箱）中培养，取对数生长期细胞进行试验。4、实验动物昆明种小鼠80+只，体重18-22g，雌雄各半，清洁级，由苏州大学实验动物中心提供。方法与结果一、荷瘤小鼠模型建立H22细胞在37、5%CO2培养3d，以无血清RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1107 mL-1，取0.2mL注入小鼠腹腔内。7d后将小鼠颈椎脱臼处死，于75%乙醇浸泡12 min后抽取腹水，用生理盐水稀释，吸管充分吹打均匀，1 000 rmin-1离心5 min，倾出上清，加生理盐水稀释成1107 mL-1的腹水瘤细胞悬液，移入玻璃瓶内，将玻璃瓶放于冰水槽里冰浴。用注射器抽取细胞，每只小鼠右腋皮下接种0.2mL瘤液(2106个细胞)。二、给药剂量与方法将接种后的小鼠随机分为10组，每组10只。用生理盐水做空白组；分别用Ost、Ost-S100-NP、Fd- Ost-S100-NP的低、中、高剂量组为实验组。药物3个剂量组为1.0mg/kg、2.0mgkg、4.0 mg/kg，每只给药0.2ml/d。腹腔注射给药，每日一次，共给药8d。同时，每日用天平称所有荷瘤小鼠的体重。三 、观察指标给药8d后颈椎脱臼处死各组小鼠，完整剥离肿瘤并称重，另取出肝、脾脏、胸腺并分别称重。按式4-1、4-2分别计算抑瘤率(inhibition rate on tumor weight, IRW)、脾指数、胸腺指数，统计体重增长和肝重：(4-1)脾指数或胸腺指数 /mgg-1=脾脏或胸腺重量/体重(4-2)四、纳米粒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性1. 纳米粒对H22荷瘤小鼠体重的影响对比表4-1中各组小鼠的处死时体重变化，发现Ost及其两种纳米粒制剂均对小鼠的体重有一定抑制作用，且剂量越大抑制体重越明显。这可能是抗肿瘤药物Ost的副作用造成的。对比相同剂量Ost、Ost-S100-NPs、Fd-Ost-S100-NPs的小鼠体重，可见纳米粒及其冻干纳米粒组对小鼠体重的抑制作用较小，减轻了药物的副作用。这应当与其在体内的肝靶向性分布，减少药物在其它组织和细胞中的分布有关。表5-1：纳米粒对H22荷瘤小鼠的体重抑制作用Fig.5-1: Body weight on tumor weight in H22-bearing miceGroupDose/mgkg-1NumberBody weight /gprepostSaline-1023.52.136.22.0Ost1.01023.42.032.21.52.01023.31.930.82.24.01023.42.530.12.3Ost-S100-NPs1.01023.12.235.91.72.01024.02.533.81.54.01023.11.432.42.6Fd-Ost-S100-NPs1.01023.62.435.01.72.01023.61.932.92.14.01022.92.831.21.92. 纳米粒的抑瘤率对比表5-2各实验组的抑瘤率与空白组比较均有统计学差异, 抑瘤效果显著。由表可以看出，随着给药浓度增加，药物的抑瘤率均上升。Ost-S100-NPs和Fd-Ost-S100-NPs都可以增强Ost对小鼠肿瘤的抑制作用，反映了其在体内良好的肝靶向分布和抗肿瘤活性。同种剂量情况下，Ost-S100-NPs的抑瘤效果最佳，纳米粒的冻干粉制剂效果次之，原料药作用最低。表5-2：纳米粒对H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用Fig.5-2: inhibition rate on tumor weight in H22-bearing miceGroupDose/mgkg-1NumberTumor weight/gIRW/%Saline-100.8990.254-Ost1.0100.7930.26811.752.0100.7340.37518.324.0100.6560.28627.03Ost-S100-NPs1.0100.7000.29222.132.0100.5110.17543.114.0100.3930.20856.20Fd-Ost-S100-NPs1.0100.7130.25820.642.0100.5440.17939.534.0100.4240.22552.813. 脏器指数比较 胸腺和脾脏为体内的主要免疫器官。胸腺为初级淋巴器官，游走的造血干细胞进入胸腺原基，在此分化增殖成T淋巴细胞，与细胞免疫有关。脾脏为次级淋巴器官，免疫活性细胞移行于此，并在此处因免疫过程中异体抗原刺激而进一步增殖分化和成熟，脾脏中有T淋巴细胞和B淋巴细胞，还有巨噬细胞，与体液免疫、细胞免疫均有密切关系，一些免疫抑制剂均可使胸腺、脾脏明显萎缩，免疫增强剂则使胸腺或脾脏增重。表5-3中脏器指数结果表明，荷瘤鼠的脾指数和胸腺指数都比正常小鼠的免疫指数略大一些，可能是接种肿瘤后刺激了免疫系统，使脾脏制造大量的淋巴细胞和免疫球蛋白参与机 体的免疫反应,也可能是吞噬作用或病理性增大 。给药组的肝重比生理盐水对照组均有不同程度的降低，其中以原料药组的肝抑制效果最为明显，而Ost-S100-NPs与Fd-Ost-S100-NPs则对肝生长的抑制作用较低，这说明相对于原料药，蛇床子素纳米粒及其冻干制剂具有低毒的作用。表5-3：H22荷瘤小鼠的脏器指数(n10，s)Tab.5-3: organ coefficient in H22-bearing miceGroupDose/mgkg-1Liver weight /gSpleen index/mgg-1Thymus index/mgg-1Saline-1.980.2110.850.251.020.38Ost1.01.500.3212.270.261.200.232.01.620.1913.800.371.660.154.01.710.2514.290.281.450.34Ost-S100-NPs1.01.940.1811.820.291.300.262.01.590.2411.340.171.580.134.01.750.1411.470.201.400.39Fd-Ost-S100-NPs1.01.800.2811.780.251.260.522.01.650.1912.540.171.600.414.01.730.1712.420.221.420.254、小鼠肿瘤的病理组织学观察荷瘤小鼠肿瘤的病理组织学观察采用配有电子成像技术的生物显微镜。10%中性甲醛溶液固定每组剥离的肿瘤，用石蜡包埋，制片，HE染色，生物显微镜下观察并对典型区域进行拍照。显微镜照片见图5-2。图5-2中生理盐水组、低剂量Ost原料药对照组、纳米粒组及其冻干制剂组多见的大片肿瘤组织和少量肿瘤坏死组织,肿瘤细胞相对比较完整，排列紧密，没有出现明显的坏死区。小鼠皮下剥离的肿瘤组织中见明显横纹肌组织，瘤细胞异型明显，核深染分裂，大小不等，呈低分化癌状态。中、高剂量给药组多见的大片肿瘤坏死组织。可直观反映出纳米粒制剂增强Ost对肿瘤的杀伤作用。图5-2(g)为肿瘤坏死组织的放大图，可见有大量炎症细胞浸润,以及坏死细胞的脱落。 (a)生理盐水组 肿瘤组织(100) (b)生理盐水组 横纹肌（100） (c)Ost原料药（低） 少量坏死(100) (d)Ost-S100-NP（中） 小灶坏死(100) (e) Ost-S100-NP(高) 大量坏死(100) (f) Fd-Ost-S100-NP(高) 大量坏死 (100) (g) Ost-S100-NP高剂量组 炎症细胞(400)图5-2: 小鼠肿瘤的病理组织学观察Fig. 5-2: Pathohistological observation of n