油菜硫苷组分含量及抑菌活性研究.doc

油菜硫苷组分含量及抑菌活性研究武汉植物学研究2006,24(4):351356JournalD,WuhanBotanicalResearch油菜硫苷组分含量及抑菌活性研究李锋,张春雷,李光明(中国农业科学院油料作物研究所作物生理与可持续农业研究室,武汉430062)摘要:对油菜不同器官硫苷的组分与含量进行分析,结果表明根系和茎中的硫苷总量显着高于叶片,根系中的硫苷以4.甲氧基.3.吲哚甲基硫苷和1.甲氧基.3.吲哚甲基硫苷为主,茎和叶中以2?羟基一3一丁烯基硫苷和苯乙基硫苷为主.油菜根系中的硫苷组分从冬前期到终花期基本保持稳定,硫苷各组分的含量在不同生育时期的变化基本一致,终花期含量最高,成熟期含量最低.19个油菜品种根系中硫苷组分与含量存在较大差异;以草莓灰霉菌为靶标物,研究油菜根系的挥发性水解产物和水溶性水解产物对土传病原真菌的抑制作用,发现不同油菜品种根系水解产物的抑菌活性与其硫苷组分与含量有关,草莓灰霉菌对丁烯基ITC非常敏感,吲哚类1TCs对草莓灰霉生长的抑制作用要低于芳香族ITCs.关键词:硫苷;生物熏蒸;甘蓝型油菜中图分类号:Q946.839;$565.4文献标识码:A文章编号:1000470X(2006)04035106CompositionandContentofGlucosinolatesinRapeseedandinvitroInhibitionofBotoytiscinereaPersoonLIFeng,ZHANGChunLei,LIGuangMing(CropPhysiology&SustainableAgricuhureDivision,InstituteofOilCropsResearch,CAAS,Wuhan430062,China)Abstract:Thecompositionandcontentofglucosinolatesinroot,stemandleafofrapeseed(Brassica胞一pus)wereanalyzed.Theresultsshowsthatwithinroot4-methoxyglucobrassicinandneoglucobrassicinpredominated,whileinleafandroottissueprogoitrinandgluconasturtinwerethemostabundant.Fromprewinterstagetofinalfloweringstage,theprofileofglucosinolatesinrootwereconstant,whilethecontentsofglucosinolateswerecongruouslyvariable,highestinfinalfloweringstage,andlowestinmaturestage.Thereweresignificantdifferencesbetweentheprofileandconcentrationofglucosinolatesinrootof19rapevarieties,whichmaypartiallyaccountfordifferencesininhibitionofB.cinereamyceliumgrowthbyhydrolyticcompoundsreleasebyrootofdifferentrapevarieties.ItcanbepresumedthatB.cinereaisverysusceptibletobutenylITC,andthemyceliumgrowthinhibitionofindoleITCwaslessthanthatofaromoticITC.Keywords:Glucosinolates;Biofumigation;Brassicanapus硫代葡萄糖苷(glucosinohe,简称硫苷)是芸薹属(Brassica)和十字花科其它植物中重要的一类植物次生代谢产物.硫苷在内源芥子酶的作用下水解产生许多生物活性物质,尤其是异硫氰酸酯(isothiocyanates,ITCs).ITCs对线虫,细菌,真菌和昆虫都具有很强的杀生作用,这种生物活性可以用于病虫害的生物防治.以芸薹属植物作绿肥或填休作物,或与其它作物轮作,或者将油菜饼粕作土壤改良剂混人土壤中,所释放出的ITCs具有抑制病虫害的作用.已有的研究表明,这种生防作用的效果与植株硫苷组分及其含量密切相关;油菜叶片中硫苷含量与其对病虫害的敏感性有关,当植株受到病害或害虫侵袭时,组织中硫苷的含量急剧上升.油菜是最重要的油料作物之一,全世界年种植面积达2200万hm,这相当于蕴含了大量的生物农药.如果加以合理的开发利用,无论对目前的无公害农产品的生产,还是对长远的人类社会的可持续发展都具有重大意义.硫苷水解产物对动物具有毒性及抗营养作用,通过品质育种和栽培技术降低油菜种子中硫苷的含量,取得了显着的成效.已有的研究表明,油菜种子与其营养器官中硫苷含量并不收稿日期:2006-01-26,修回日期:200643418.基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270802).作者简介:李锋(1979一),男,硕士,主要从事作物生理,油菜栽培管理及生防研究.十通讯作者(Authorforcorrespondence.Email:clzhangrip.sina.corn).352武汉植物学研究第24卷存在相关性,它们的生物合成分别由不同的基因控制,因而有可能培育出种子中低硫苷,营养器官中高硫苷的品种.笔者系统分析了油菜各营养器官硫苷的组成与含量,不同生长时期以及不同品种间硫苷组分的差异,同时还初步研究了油菜根系中硫苷降解产物对草莓灰霉菌的抑制作用,以期为油菜生防作用的开发与应用提供理论依据.1材料与方法1.1材料以中油821,9715,浙油758,92-98系,湘油l5号,花叶9918,豫油2号,634,军农1号,Q93,kw.33,954,中油杂8号,中双9号(以上l4种分别由育种人或品种保藏单位提供),103,Bronowiski,走马洋油菜,1470,Mamoo(以上5种由本所种质资源研究室提供)等l9份甘蓝型油菜品种为供试材料.2004年秋播于中国农业科学院油料作物研究所试验农场.于油菜冬前期(12月20日),初花期(3月l7日),终花期(4月13日),成熟期(5月11日)分别将每品种l0株油菜完整根系挖起来.用水冲净后按根,茎,叶分开(成熟期时只取根系),分别切碎(长,宽各1em左右),每个样取200g封装于样品盒中,置一70超低温冰箱备用.1.2方法1.2.1样品制备将冷冻样品置于冷冻离心干燥机内真空干燥,用高速粉碎机粉碎,过筛(筛孔直径1rfllT1),干粉真空包装,置一40C冰箱保存.1.2.2完整硫苷组分与含量分析采用ISO9167.1:1995高效液相色谱国际标准方法,在农业部油料及制品监督检验测试中心进行.硫苷提取准确称取0.2000g制备好的样品至离心管中,75恒温水浴灭活1min,加人2mL70%甲醇和200txL丙烯基硫苷做内标,离心,转移上清液至试管中,再加人2mL70%甲醇提取并离心,重复3次,3次提取液合并为硫苷粗提液.活化醋酸型DEAE.SephadexA-25阴离子交换柱,加2mL粗提液,硫酸酯酶500txL于阴离子交换柱上,36培养箱中恒温酶解20h.而后用纯水洗脱,每次1mL,重复洗脱3次,收集并合并洗脱液,用0.45m的微孔滤膜过滤,滤液人样品瓶封口保存.高效液相色谱分析使用美国Waters公司的液相色谱仪,包括两台高压泵,自动进样器,二极管阵列检测器,色谱柱为SphefisorbC18柱(150rfllTl4rfllT1),流动相为20%乙腈,检测波长为229nm,柱温为30,进样量l0L,所有样品重复2次,按国际方法进行硫苷分量色谱峰定性,硫苷含量结果以txmol?g表示.1.2.3油菜根系水解产物的抑菌活性测定供试菌种为草莓灰霉菌(BotoytiscinereaPer.soon),由本研究室从草莓病果分离保藏.油菜根系挥发性水解产物的抑菌活性测定参照Kirkegaard法略作改进,在直径为8mm培养皿盖子里面粘结一直径为4em,高1em的塑料圈.高温灭菌后,在培养皿中倒人PDA培养基,放至常温时接种直径为0.5em的菌块;往盖子的塑料圈里加入冷冻干燥的油菜根系粉末:处理A加入根系粉末0.1g,0.5mL灭菌水;处理B加0.4g根系粉末,2.0mL灭菌水;对照仅加2.0mL灭菌水,4次重复.然后将接种了微生物的那一半培养皿倒扣在培养皿盖子上,而后用封口膜密封,25恒温培养72h后,测量菌斑直径.除去培养皿盖中的油菜根系粉末,在超净工作台上通风20min,继续培养72h,再次测量菌斑的直径.油菜根系水溶性提取物的抑菌活性测定参照Lazzeri法略作改进,称取冷冻干燥的油菜根系粉末放人20mL带盖试管,加入8mL无菌水.处理a和处理b仅添加的油菜根系粉末的量不同,分别为0.1g和0.4g,对照的试管中只加无菌水.37振荡12h,17000r/min离心30min,取上清液于超净工作台上用0.22txm微孔滤膜过滤.取3mL滤液,0.1g/mL的硫酸链霉素0.1mL添加到7mL40熔融的PDA培养基中混匀,平铺于直径8em的培养皿中,至常温时接种直径为0.5cm的菌块,用封口膜密封,25恒温培养72h,测量菌斑直径.2结果与分析2.1油菜营养器官中硫苷的组分与分量低硫苷品种中油杂8号根,茎,叶硫苷的分量与总量都明显要低于高硫苷品种中油821(表1),这与MiZen的无论是双低油菜品种还是单低油菜品种,叶片有相似的硫苷浓度的研究结果不同.这可能与所用品种的育种途径有关.油菜各部分硫苷的组分与含量存在差异,根系和茎中硫苷明显要高于叶片.根系中硫苷组分主要是4.甲氧基.3.吲哚甲基硫苷和1.甲氧基.3.吲哚甲基硫苷,茎和叶中则以2.羟基.3.丁烯基硫苷,苯乙基硫苷为主.中油杂第4期李锋等:油菜硫苷组分含量及抑菌活性研究353注:A.2一羟基一3一丁烯基硫苷;B.4一甲基亚砜丁基硫苷;C.2一羟基4一戊烯基;D.3-丁烯基硫苷;E.4-戊烯基硫苷;F.苯甲基硫苷;G.苯乙基硫苷:H.4一羟基_3一吲哚硫苷;I.3-吲哚甲基硫苷;J.1一甲氧基.3_婀I哚甲基硫苷;K.4-甲氧基一3一吲哚甲基硫苷.一表示未达到检测水平.下同.Notes:A.Desulfoprogoitrin;B.Desulfoglucoraphanin;C.Desulfogluconapoleifefin;D.Desulfogluconapin;E.Desulfoglueobrassicanapin;F.Desulfoglucotropaeolin:G.Desulfogluconasturtin;H.Desulfo-4一hydroxyglucobrassicin;I.Desulfoglucobrassicin;J.De8ulf04一methoxyglueobrassicin:K.Desulfoneoglucobrassicin.一indicatesundetectedleve1.Thesalxlea8below.8号根组织中吲哚类硫苷占总硫苷的89.6%,茎,叶组织中脂肪族硫苷分别占硫甙总量的52.1%和44.O%,芳香类硫苷占总硫苷的28.1%和28.O%.中油821根组织中吲哚类硫苷占总硫苷的50.1%;肪肪族硫苷也占比较大比例,达37.2%;茎,叶组织中脂肪族硫苷分别占总苷的63.2%,44.O%,芳香族硫苷则分别占19.3%和38.O%.2.2油菜不同生育时期根系硫苷组分与分量油菜根系中的硫苷组分从冬前期到终花期基本保持稳定(表2).硫苷各组分的含量在不同生育时期的变化基本存在一致性,终花期含量最高,成熟期含量最低,甚至有些硫苷分量在成熟期的含量在可检测水平以下.Sarwar认为同一油菜品种在不同的生长环境及不同的生育时期,硫苷的类型保持相表2不同生育时期油菜根系硫苷组分与分量的变化Table2Changesofglueosinolateprofilesinrootduringdifferentgrowthstageforrapeseed对稳定,除非植株受到昆虫的侵害或者机械损害.本研究结果与之相一致.2.3油菜根系中硫苷组分与含量各油菜品种根系中的硫苷总量有较大差异(表3),含量最高的是花叶9918,达25.6tunol?g,含量最低的是1470,仅0.32tzrnol?g.从完整硫苷的分量上来看,则以吲哚类硫苷为主,其中花叶9918,中双9号,中油杂8号以及1470表现较为典型,其吲哚类硫苷占总硫苷的80%以上.中油821脂肪族硫苷和芳香类硫苷含量也比较高.Kirkegaard_3认为芸薹属植物根系中的硫苷以芳香族的为主,主要是2-苯乙基硫苷,苯甲基和p.羟基苯甲基硫苷含量也较高.我们的实验结果与Kirkegaard不尽一致,可能与供试油菜品种起源与栽培条件不同有关.354武汉植物学研究第24卷2.4油菜根系硫甙降解产物对病原真菌的抑制作用2.4.1油菜根系挥发性水解产物对灰霉菌菌丝生长的抑制作用油菜根系组织解体时,其中的硫苷水解产生的挥发性物质对灰霉菌菌丝的生长有抑制作用,添加到培养皿中的根系组织量越多,所产生的挥发性物质越多,对菌丝生长的抑制作用也越强(图1).油菜根系硫苷的水解产物,其毒性及对真菌的抑制作用存在显着的品种差异,浙油758和1470根系硫苷含量较低,对菌丝生长的抑制作用非常小;而在处理B中,同样添加0.1g中油821或92-98系的根系材料,所产生的挥发性水解产物都对菌丝产生明显的抑制作用,分别达到85.3%和64.5%,两品种间差异达到显着差异;处理A所添加的根系粉末为0.4g时,两品种根系的挥发性水解产物都能使菌丝的生长完全受抑制,将培养皿中的根系去除后继续培养72h,未发现菌丝有生长的迹象,这说明,根系硫苷水解所产生的挥发物质起到了杀菌的效果.花叶9918,豫油2号以及走马洋油菜在两个处理中,都有一定的抑制效果,但显着低于中油821和92-98系.添加浙油758和1470根系材料的处理,未检测到抑菌活性.H1,H2,1-13,M1,M2,L1,I2分别代表不同油菜品种:花叶9918,9298系,中油821,豫油2号,走马洋油菜,浙油758,1470;处理A,B(或者a.b)代表不同油菜根系的量:0.4g,0.1g.下同.H1.H2,H3,M1.M2.L1,I2representrespectivelydifferentmpevarietiesa8followings:Lacerate9918.l.Line92-98,Zhongyou821,Yuyou2,Zoumayang,Zheyou758,1470;TreatmentA,B(Ora,b)representrespectivelydifferenttreatmentdiflexedina/IlOtlntofroot.The$a/Iletit8below图1油菜根系挥发性水解产物对灰霉菌菌丝生长的抑制作用Fig.1InhibitionofB.cinereamyeelium.0wthbyvolatilehydrolyticcompounclsreleasebyrootofrapeseed2.4.2油菜根系可溶性水解产物对灰霉菌菌丝的抑制作用油菜根系可溶性水解产物对灰霉菌菌丝生长也存在抑制作用,根系组织或残留物越多,即培养皿中水溶性物质的量越高,这种抑制作用愈强(图2).舳加Ou.Ic0葛j一1IoJ吐吐cj一一讲摹露,弄州划坦第4期李锋等:油菜硫苷组分含量及抑菌活性研究355不同品种根系的水解产物的抑制作用存在显着差异,低硫苷品种浙油758和1470对菌丝生长的抑制作用非常小;处理a中,即根系为0.4g时,中油821和9298系根系的水溶性水解产物对菌丝生长的抑制作用分别达到94.8%,100%,处理b中,抑制率分别达52.3%,48.5%,均显着高于其它品种.巳附铎:【耀H1H2tt3MlM2LlL2图2油菜根系可溶性水解产物对灰霉菌菌丝生长的抑制作用Fig.2InhibitionofB.cinereamyceliumgrowthbywatersolublehydrolyticcompoundsreleasebyrootofrapeseed3讨论关于芸薹属植物种间硫苷含量的差异,国外已有不少的研究-6.Kirkegaard等认为芸薹属植物地上部组织中脂肪族硫苷占主要成分,根系中的硫苷以芳香族的为主,主要是2一苯乙基硫苷.吲哚类硫苷广泛存在于各器官组织中,浓度相对较低,只在一些甘蓝(B.oleracea)蔬菜组织中含量较高.Mithen发现油菜根系和茎中以吲哚类硫苷为主,而叶片中脂肪族硫苷最丰富.硫苷含量除受基因调控外,外界环境条件以及栽培措施也有很大的影响,如用茉莉酸甲酯涂抹或喷施油菜叶片,能诱导油菜茎叶组织中吲哚类硫苷显着增加.在本研究中(表1),油菜茎和叶中以2一羟基一3一丁烯基硫苷,苯乙基硫苷为主,根系中的硫苷则以4一甲氧基一3一吲哚甲基硫苷和1一甲氧基一3一吲哚甲基硫苷为主,如花叶9918,中双9号,中油杂8号以及1470等品种的根组织(表3),其吲哚类硫苷占总硫苷的80%以上.中油821脂肪族硫苷和芳香类硫苷含量也比较高.可见,硫苷组分及其含量在不同油菜品种及不同器官存在差异.在芸薹属植物生长发育过程中,硫苷组分和含量还具有动态变化的特征,即在植物不同生育阶段组织中硫苷组分和含量明显不同10.Sukhi发现总硫苷浓度在种子萌芽的前5天增加.从种子萌发到现蕾硫苷浓度降低,茎秆中硫苷浓度的变化显着大于叶片HJ.硫苷浓度变化较明显时期是苗前期和抽薹期,期间吲哚类硫苷含量呈上升趋势.油菜和甘蓝花期硫苷有较高的积累量.营养器官硫苷总含量花后下降,在成熟期呈痕量水平.从表2看来.油菜根系中的硫苷组分从冬前期到终花期基本保持稳定.硫苷各组分的含量在不同的生育时期的变化基本存在一致性,终花期含量最高,成熟期含量最低.油菜根系中硫苷的水解产物异硫氰酸被认为是根系水解物中对真菌抑制作用最强的降解产物引.本实验中高硫苷的根系水解产物对菌丝生长的抑制效果显着高于低硫苷的根系,进一步说明硫苷水解产物ITCs对真菌生长的抑制作用.ITCs的生物学活性决定于侧链R的特性和化合物的浓度及病虫害的类型川;以溶有ITCs的琼脂培养基培养真菌,ITCs对真菌的毒性因其化学结构和侧链长度而异,脂类和芳香类ITCs随着侧链长度的增加毒性均有减少的趋势,即甲基ITC=2一丙烯基ITC>丁基ITC>戊基ITC,苯基ITC>2一苯乙基ITC,芳香基ITCs的毒性要强于脂类ITCs,若仅让挥发性的ITCs气体与菌丝接触,活性最强的ITC是丙烯基ITC川.本实验中,中油821和92-98系根系的硫苷总量低于花叶9918,但无论是挥发性水解产物还是水溶性水解产物对真菌的抑制作用前者明显要高于花叶9918,说明油菜根系组织中硫苷的组分与分量在抑制病原真菌中的作用远大于硫甙总量.花叶9918根系中吲哚类硫苷占83.38%,脂肪族硫苷仅占8.31%,芳香类硫苷几乎检测不到,而中油821和9298系根系中脂肪族硫苷分别占37.02%,15.42%,芳香族硫苷分别占8.19%,12.95%.在根系挥发性水解产物对菌丝生长的抑制作用中,能产生挥发性ITCs的硫苷主要是脂肪族硫苷,有试验表明,丁烯基ITCs对真菌有明显的抑制作用,甚至要高于甲基ITC.本实验中0.1g中油821根系所产生的挥发性水解产物对菌丝生长的抑制效果达到85.3%,而0.4g中油821和9298系根系的挥发性水解产物对草莓灰霉有致死作用,可见草莓灰霉对丁烯基ITCs非常敏感.而在水溶性降解产物实验中,由于挥发性的ITCs经充分振荡后大部分已挥发,能发挥作用的主要是芳香类和吲哚类的ITCs.前人研究表明,苯甲基和苯乙基对大部分真菌都有较强的抑制作用,因而推测花叶9918根系的水溶性降解产物对草莓灰霉的抑制作用明显低于中油821和92.98系的原因可能与其不含芳香类硫苷有关.芒善IlIqI【IIII【1-;.=356武汉植物学研究第24卷另外,吲哚类ITCs对草莓灰霉生长的抑制作用要低于芳香族ITCs.油菜茎秆和叶片中的硫苷以2-羟基.3.丁烯基硫苷,苯乙基硫苷为主,因而高硫苷含量的油菜茎和叶作为草莓灰霉病的生物防治可能是比较理想的生物农药.致谢:中国农业科学院油料作物研究所食品安全与质量标准研究室张文高级工程师,国家蔬菜工程技术中心何洪巨副研究员在硫苷组分与含量分析中给予了一定帮助,在此致谢!参考文献:1BrownPD,MorraMJ,McCafferyJP,AuldDL,WilliamsL.AllelochemicalsproducedduringglucosinolatedegradationinsoilJ.JChemEco,1991,17:20212034.2RosaEAS,HeaneyRK,FenwickGR,FenwickGR.Glucosi-nolateincropsplantsJ.HortRev,1997,19:99183.3KirkegaardJA,SarwarM.BiofumigationpotentialofBrassicas.1.Variationinglucosnolateprofilesofdiversefield-grownBrassicasJ.PlantandSoil,1998,201:7189.4MilfordGFJ,FieldsendK,PoerAJR,RawlinsonCJ.Chan-gesinglucosinolateconcentrationduringthevegetativegrowthofsingleanddoublelowcultivarsofwinteroilseedmpoJ.AspplBio1.1989,23:8390.5SchillingW,FriedtW.Breeding00-rapeseed(Brassica唧)withdifferentialglucosinolatecontentintheleavesC.Saskatchewan:ProceedingsoftheEighthInternationalRapeseedCongress.Saskatoon.Canada,1992,250255.6MithenR.LeafglucosinolateprofilesandtheirrelationshiptopestanddiseaseresistanceinoilseedrapeJ.Euphytica,1992,63:7l一83.7IntemationalOrganizationforStandardization.IS09167-1:1995.Rapeseed.Determinationofglucosinolatescontent.Methodusinghi【gh-performanceliquidchromatographyS.August15.1993.(8KirkegaardJA,WongPTW,DesmarchelierJM.Invitrosup?910121314151617pressionoffungalrootpathogensofcerealsbyBrassicatussuesJ.Plantpathology,1996,45:593603.LamriL,LeoniO,ManiciLM.BiecidalplantedpelletsforbiofumigationJ.Indmtrialcropsandproduc,2004,20(1):5965.SalwalM,KirkegaardJA.Biofumigationpotentialofbrassicas.11.Effectofenvironmentandont