牙周病分子生物学课件

牙周病分子生物学MolecularBiologyofPeriodontalDiseases 李德懿上海第二医科大学附属第九人民医院 一 概述二 牙周病的分子致病1 微生物的毒力因子2 宿主因子三 核酸杂交法检测牙周病有关细菌 定义 Definition 分子生物学技术研究与牙周病密切相关生物大分子 蛋白 核酸 的一门新兴学科 前瞻性 交叉性 研究内容宿主基因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流行规律牙周病原菌的蛋白和核酸 DNA RNA 分子结构 追踪病原菌传播途径 发现病原体变异 牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因特征联系起来 牙周病临床的分子诊断 分子指征 分子预后乃至基因治疗 牙周病的分子致病MolecularPathogenesisofPeriodontalDisease 微生物的毒力因子研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子结构 评价毒力因子的作用 宿主因子研究细胞因子和遗传因子的作用 微生物的毒力因子MicrobialViralenceFactors 内毒素 lipopolysaccharide LPS G 菌胞壁外膜的脂多糖成分 磷脂 多糖 蛋白质 十二烷基磺酸钠 聚丙烯凝胶电泳PAGE SDSgel银染色Silverstain内毒素 免疫印迹LPS immuno blotting 牙龈素 gingipains 最初称为胰酶样蛋白酶 trypsin likeprotease TLP 又称卟啉素 porphypains 存在于Pg的外膜 膜泡或胞外的一组蛋白酶超速离心 10000g 20min 4 提取胞外膜泡 高凝胶液相色谱法 GF HPLC 分离纯化 精氨酸 牙龈素 Arginine gingipains Rgps 特异性切断蛋白质与精氨酸残基结合的肽段 由rgpA 前肽区 蛋白酶区 粘附区 和rgpB 无粘附区 二个基因编码赖氨酸 牙龈素 Lysine gingipain Kgp 特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段 由kgp 前肽区 蛋白酶区 粘附区 单个基因编码 Pg同源突变株的性状改变突变株性状改变rgpA粘附能力部分丧失降解I型胶原能力丧失rgpA rgpB抑制中性粒细胞功能丧失菌毛缺失kgp菌落无法变黑 影响利用血红蛋白 rgpA rgpB kgp胞外蛋白水解活性丧失 牙龈素功能有助于粘附定植 对纤维蛋白的亲和力 毒性作用 破坏宿主组织细胞的活性成分 蛋白 多肽 降解胶原 促进缓激肽释放 提高血管通渗性 增加龈沟液量 组织水肿 帮助细胞生长 将组织蛋白质降解为短肽链 扩大细菌营养摄取范围 为细菌生长和毒力发挥提供养分 干扰宿主免疫反应 影响中性白细胞功能 降解宿主细胞的LPS受体CD14 降解细胞因子IL 1 IL 6 IL 8及TNF 等 菌毛亚单位蛋白结构基因 fimA 粘附有关的毒力因子 纤毛素 fimbrilin 粘附素 adhesin 血细胞凝集素 hemagglutinin 1988年Dickinson等首先获得含编码Pg纤毛素基因的克隆质粒PUC13Bg12 1 该基因为染色体上的单拷贝基因 它的氨基酸序列与其他菌毛无同源性 可利用该特异基因作探针鉴定Pg 可进一步研究Pg菌毛的致病作用 胶原酶基因 prtc Pg的胶原酶能降解I型胶原 破坏牙周组织附着 已测知表达胶原酶活性的prtc基因序列 它存在于Pg的三种主要血清型中 编码1个37501 38 蛋白质 白细胞毒素基因 lktA B C D Aa是口腔中唯一能产生白细胞毒素 leukotoxin LKT 的细菌 白细胞毒素仅能杀死人或灵长类的多形核白细胞 单核细胞和巨噬细胞 抑制破坏宿主的免疫防御机制 现已克隆和测知lktA的序列 且在受体菌中得到表达 编码毒素结构 激活白细胞毒素 宿主因子HostFactors 细胞因子 cytokines 细胞生物学细胞因子cytokine CK 免疫学淋巴因子lymphokineinterleukincytikine LI 血液学集落刺激因子colonystimulationfactor CSF 分子生物学生长因子growthfactors GFS 活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的微量生物活性物质 本质是蛋白质或多肽 在体内发挥广泛的生物学作用 与生长 分化 免疫 肿瘤 造血和创伤愈合等多种生理 病理状态有关 正常情况下发挥广泛生理功能 一旦失调异常分泌 又与疾病相关 目前发现的细胞因子有10余族 每族又有若干亚族 共100多种 功能大多已阐明 部分已克隆成功 其基因定位 结构与受体结合机制等均有大量研究 白介素 1 18型糖蛋白 interleukin IL 肿瘤坏死因子 tumornocrosisfactor TNF 粘附分子 adhesionmolecule AM 干扰素 interferan IFN 转化生长因子 transforminggrowthfactor TGF 成纤维细胞生长因子 fibroblastgrowthfactors FGFs 细胞因子作用特点特异性 自分泌 旁分泌作用 对靶细胞存在不同程度特异性 多样性 多功能性对不同靶细胞 不同浓度或不同生理状态靶细胞可有不同作用 整体性对细胞 组织的调控不是仅靠1种 而是多因子参与及多步骤反应 由几种因子协同或拮抗配合形成网络 network 发挥作用 遗传因子 geneticfactors 基因水平阐明牙周病发生 发展和流行规律 细菌是引发牙周炎必不可少的因素 但不是唯一因素 宿主也起重要作用 单纯遗传能为患严重牙周炎提供50 以上危险性 如 白细胞减少症白细胞粘附缺陷病Down综合征掌跖角化 牙周破坏综合征 牙周病的基因研究6号染色体组织相容性位点变异产生IgG2能力降低 IgG2是保护性的 能调理识别细菌 以利吞噬杀死 染色体1qH131残基多态性组氨酸纯合子吞噬细胞识别IgG2的hFcrR a受体亲和力高 IgG包裹的致病菌易被吞噬清除 精氨酸纯合子受体亲和力低组 精氨酸杂合子亲和力居中 染色体2q13的IL 1 基因多态性产生的IL 1 约为该基因阴性的4倍 40岁后患重度牙周炎的可能性是阴性个体的20倍6号染色体TNF 基因多态性产生大量TNF 增强对感染的反应性 核酸杂交法 molecularhybridization 检测牙周病相关细菌 概述 细菌分类学四个水平细菌形态和行为水平 显微结构 运动性 酶 生化及营养需要等细菌组分水平 胞壁组分 脂类 细胞色素及噬菌体系分析蛋白质水平 氨基酸系列 可溶性蛋白凝胶电泳及血清学基因水平 G Cmol DNA DNA杂交 质粒及遗传物质的转导 牙周病有关的特殊细菌证据充分的致病菌中等证据的致病菌伴放线放线杆菌Aa直肠弯曲菌 Actinobacillusactinomycetemcomitans campylobacterrectus 牙龈卟啉单胞菌Pg缠结优杆菌 Porphyromonasgingivalis Eubacteriumnodatum 福塞似杆菌Bf具核梭杆菌Fn Bacteroidesforsythus Fusobacteruimnucleatum 中间普氏菌Pi prevotellaintermedia 微小消化链球菌Pm Peptostreptocoscusmicros 中间链球菌群 Intermediusstreptococci 牙密螺旋体Td Treponemadenticola 常规方法不能鉴定牙周大量标本细菌的原因 大多为厌氧菌培养条件要求高鉴定繁杂每牙周袋至少取2个区样本每样本至少分离10株以上可疑菌 原理所有生物体都以DNA形式通过4种碱基顺序来贮存遗传信息 同种生物含相同的DNA序列 生物种差别越大 DNA碱基顺序差别越大 鸟嘌呤腺嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶G A C TCT示踪剂标记的特定碱基序列的核酸片段 能和互补碱基配对 特异地结合 4种核苷酸组成DNA2条互补链绕成双螺旋结构 氢键 严格配对规律牢固结合 使DNA具遗传信息贮存库功能 恒定性 专一性 DNA上相邻3个核苷酸编排1个密码子 决定1个特定氨基酸DNA核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸顺序 决定细胞结构和功能 核酸探针 probe 定义能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段 用于检测待测样品中是否存在与探针相同或相近的DNA序列 牙周病相关菌的核酸探针是牙周病相关菌染色体DNA上的有种属特异性的一小段DNA 或RNA 分子的碱基序列 为带标记的单股核苷酸 能以互补方式与相应DNA键结合 用已知细菌的DNA探针去探测未知细菌的DNA 若能杂交形成DNA双链则认为该菌为与探针相同的菌 放射性同位素标记 如32P 35S 3H灵敏度高理化影响小污染环境使用某些半抗原 如生物素 地高辛 荧光素特异性较低敏感性较低 合成小段单链DNA方法日臻完善寡核苷酸的化学合成可由高度自动化的仪器完成核酸杂交技术得到发展 探针类型全基因探针 属内代表菌株分离出DNA并进行标记 制备简便 特异性较差 有时可与相近属菌种发生杂交克隆DNA片段探针随意探针 代表菌DNA用限制性内切酶酶切 随意克隆一些片段 找到仅能与本属内菌株杂交的DNA片段特异性高 但需大量试验方能验证其特异性特定探针 克隆属内代表菌特异性蛋白或毒力因子的基因 从该基因中取一段作为探针 检验致病菌具独特作用 但需对其特异性 敏感性验证 探针的验证特异性验证 必须与50种菌属的80 300株菌株进行杂交必须与相近细菌属中的大量菌间排除 交叉杂交 如伴放线放线杆菌 嗜血杆菌属菌株敏感性验证 必须与同属各地区分离的100株以上菌种进行杂交如核酸杂交结果与生化反应鉴定结果有出入 应进一步验证生化结果 寡核苷酸 oligonucleotide 探针序列细菌探针名称序列AaAa 2CTTCGGGCACYAGGGCTAAACCCCPgPg 1CAATACTCGTATCGCCCGTTATTCPg 3CTGTGGAATCTTGACGGTATATCGPg 4GTATAAAAGAAGTTTAAAYCCTTPg 5CCGATGCTTATTCTTACGGTACATPg 6CCTTAGGACAGTCTTCCTTCACGCBfBf 2CGTATCTCATTTTATTCCCCTGTABf 4CTGTAGAGCTTACACTATATCGCAPiPi 1GGTCCTTATTCGAAGGGTAAATGCPi 2CCCTAGGYGCGCTCCTCGCGGTTA 特定DNA片段探针序列 基因探针 细菌靶基因序列长度AaLkta5 CAGCAAGCTGCACAGTTTGCAAA 3 238bp5 CATTAGTTAATGCCGGGCCGTCT 3 16SrDNA5 GCTAATACCGCGTAGAGTCGG 3 443bp5 ATTTCACCCTCACTTAAAGGT 3 16SrDNA5 CTCAGAGATGGTTTGTGCC 3 273bp5 AGATTCACTCCCCATCGCTG 3 PgFimA5 ATAATGGAGAACAGCAGGAA 3 131bp5 TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC 3 PrtC5 ACAATCCACGAGACCATC 3 584bp5 TTCAGCCACACCGAGACG 3 16SrDNA5 AGGCAGCTTGCCATACTGCG 3 404bp5 ACTGTTAGCAACTACCGATGT 3 续表细菌靶基因序列长度Pg16SrRNA5 GCGTATGCAACTTGCCTTAC 3 518bp5 GTTTCAACGGCAGGCTGAAC 3 Fn50475 CAAATGCTTGTGTCAATAATACT 3 0 5Kb5 TTTAGAAGAAATGGTAGAATAAT 3 505905 ATTGTGGCTAAAATTASTAGTT 3 1Kb5 ACCCTCACTTTGAGGATTATAG 3 Pi18SrRNA5 CCTAATACCCGATGTCCACA 3 855bp5 AAGGAGTCAACATCTCTGTATCC 3 TdTdpA5 AAGGCGGTAGAGCCGCTCA 3 311bp5 AGCCGCTGTCGAAAAGCCA 3 PCR扩增16SrRNA基因 病原菌检测遗传学分类rRNA是细胞中最多的一种RHA 很多分子组成核蛋白体 核糖体 rRNA分子大小一般用超速离心的沉降系数S表示 S越大 分子也越大 16SrRNA基因 细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列保守区 稳定性 细菌共有 称 分子化石 可变区 特异性 保守区间有V1 V10可变区 含种属差异信息 如出现3个碱基以上差异 便可判定不同属 多拷贝 敏感性 约1500个核苷酸 每细菌含5 10个拷贝 16SrRNA编码基因保守区的引物 对所有细菌均适宜的引物可变区的引物 PCR扩增 凝胶电泳可鉴别细菌种属间隔区的引物 16SrRNA和23SrRNA编码基因间存在0 5Kb间隔区 不同种属间隔区长度的序列有特异性 可鉴别细菌种属 优点灵敏度高 特异性强 提高检测质量不依赖培养 可直接从标本检测可鉴别营养要求复杂 生长缓慢微生物 特别目前不能体外培养繁殖的细菌能克服表型变异影响 形态变化 死菌 混杂菌能鉴定菌种 毒种及亚种 提供不同病原体DNA分子 指纹 图 未解释病因学 流行病学可检测细菌对抗生素的耐药现象 缺点技术过于苛求 需一定条件和设备