浙江大学生物无机化学chapter 4课件

1 第4章金属离子与生物大分子的结合与作用 Chapter4TheBindingandActinginBetweenMetalSpeciesandBio macromolecule 2 金属 核酸相互作用 现代生物学的研究表明 核酸在结构 功能 甚至生物催化上都具有重要作用 环境中出现的重金属毒性部分源于重金属离子与核酸间的共价结构作用 重金属会干涉金属蛋白的正常调节功能 从而干涉基因的正常表达 通过了解天然金属调节蛋白在基因表达中的功能 设计出新的能与重金属特异性结合的配体 它们能像蛋白质那样捕获这些有害的重金属离子 从而阻止它们发挥作用 重金属 核酸相互作用的研究也是成功开发顺铂类抗癌药物的基础 3 金属配合物与DNA发生共价或非共价结合的作用模式 为共价结合的代表 示出与DNA碱基配位的例子 cis 二氨 合铂与鸟嘌呤N7位氮原子的共价结合 通过戊糖环上羟基形成锇酸酯键 Mg H2O 62 与磷酸根形成的静电缔合作用 4 金属配合物与DNA发生共价或非共价结合的作用模式 b 金属配合物的非共价性插入堆积作用下图示出 三联吡啶 2 羟基乙硫醇基 铂在二核苷酸d CpG 碱基对上 下及中间的插入堆积作用的晶体结构 5 金属配合物与DNA发生共价或非共价结合的作用模式 c 与配合物形成了氢键右图示出的Z型的d CG 3与Co NH3 63 鸟嘌呤碱基及磷酸骨架 P9 形成氢键的晶体结构的部分示意图 6 1 配位作用 金属与DNA间最常见的共价配合物是由软金属离子与碱基上亲核位点的配位作用而形成的 例如 在cis NH3 2Pt dGpG结构中 铂中心与鸟嘌呤碱基的N7位发生配位 从与整个聚核苷酸相互作用的层次上看 似乎仍有两个配位点可供利用的顺二氨铂中心会在一股上相邻的鸟苷酸之间形成内交联 intranstrandcrosslinking 其他会与软金属配位的碱基亲核位点还有 腺嘌呤的N7位和N1位 胞嘧啶的N3位 胸腺嘧啶和尿嘧啶的N3位 7 1 配位作用 硬度较高些的过渡金属离子还具有与磷酸根配位结合的能力 这些配合物呈现离子性而非共价性的特征 考察各种不同金属离子存在下双螺旋DNA的熔化温度 Tm 发现Tm与金属离子的浓度有关 Eichhorm等总结出金属离子与碱基或磷酸根相结合的优先选择规律 发现对磷酸根比对碱基优先选择的顺序如下 Mg II Co II Ni II Mn II Zn II Cd II Cu II 这个顺序排列由DNA双螺旋熔化温度实验得出 一般来说 碱基结合作用会使双螺旋形式去稳定 而与磷酸根的配位作用或中和作用会增加螺旋的稳定性 从而使Tm升高 8 双螺旋DNA的熔化温度 Tm 在一定理化因素作用下 核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂 变成单链的现象称为变性 denaturation 引起核酸变性的常见理化因素有加热 酸 碱 尿素和甲酰胺等 在变性过程中 核酸的空间构象被破坏 理化性质发生改变 由于双螺旋分子内部的碱基暴露 其A260值会大大增加 A260值的增加与解链程度有一定比例关系 这种关系称为增色效应 hyperchromiceffect 如果缓慢加热DNA溶液 并在不同温度测定其A260值 可得到 S 形DNA熔化曲线 meltingcurve 从DNA熔化曲线可见DNA变性作用是在一个相当窄的温度内完成的 9 双螺旋DNA的熔化温度 Tm 当A260值开始上升前DNA是双螺旋结构 在上升区域分子中的部分碱基对开始断裂 其数值随温度的升高而增加 在上部平坦的初始部分尚有少量碱基对使两条链还结合在一起 这种状态一直维持到临界温度 此时DNA分子最后一个碱基对断开 两条互补链彻底分离 通常把加热变性时DNA溶液A260升高达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度 meltingtemperatureTm Tm是研究核酸变性很有用的参数 Tm一般在85 95 之间 Tm值与DNA分子中G和C含量成正比 10 1 配位作用 金属离子与糖环部分的共价作用较少见到但十分有趣 虽然戊糖环通常不和金属离子发生配位 但却能相当容易地通过戊糖环中的C2 C3 形成锇酸酯 有人提出这一特殊的反应可以作为RNA重金属染色法的基础 事实上 OsO4的应用并不局限于同糖环的反应 也能与DNA上易接近嘧啶环的C5 C6富电子双键间相互作用 生成顺式锇酸酯 11 2 插入作用与氢键作用 金属配合物与聚核苷酸的相互作用并不只局限在金属中心与聚合物直接配位 还存在着大量选择性很高 较弱的非共价作用 一般出现在已经配位饱和的金属配合物与核酸之间 已参与配位的配体的插入作用和氢键作用是非共价缔合的典型例子 12 插入作用与氢键作用的表现形态 某些平面状的芳香杂环配体如菲咯啉及三联吡啶可以在DNA碱基对间堆积 通过偶极 偶极相互作用得到稳定 已配位的配体会发生在DNA沟内非插入性的疏水作用 配体与核酸之间的氢键作用 特别是通过与磷酸根上的氧原子间形成氢键 上图c所示 共价性的和非共价性的相互作用混合存在也是可能的 上图a中氨配体可与磷酸骨架形成氢键 13 金属及其配合物与核酸的基本反应 过渡金属配合物与核酸间的反应可分为两类 涉及金属配合物的氧化还原反应 会引起核酸的氧化作用 涉及金属中心与糖 磷酸骨架的配位反应 会引起聚合物的水解作用 14 1 氧化还原反应 Fenton反应该反应通过自由基作用于糖环 引起DNA链的断裂 用Fe EDTA 2 进行的该反应示意如下 Fe II H2O2Fe III OH OH Fe III e Fe II 15 Fenton反应产生的氢氧自由基能引起DNA链的断裂 16 Fenton反应的机理 在H2O2存在下 亚铁离子的作用能生成氢氧自由基 OH 亚铁离子本身与核酸并无明显作用 而且当它与EDTA螯合成一个阴离子配合物时 会受到核酸聚阴离子的排斥作用 但所产生的氢氧自由基却能攻击糖环上的不同位点 引起糖 磷酸骨架的断裂 其中表征比较详细的一个反应是 氢氧自由基进攻C4 位置 螺旋的小沟位置最易被扩散的自由基所接近 如上图所示 氢氧自由基与其他糖环位置上的作用也已由同位素标记等方法鉴定 与RNA的类似反应也有报道 17 氧化还原反应的另一种形式 由金属配合物引起DNA发生氧化性切割的另一种形式是 通过形成一个配位的配体自由基与螺旋结合 直接从糖环上抽去一个氢原子 而发生氧化断裂 18 2 水解作用 金属离子参与核酸水解作用是天然酶促反应的重要特征 因为人们希望开发出人工限制性内切割酶 artificialrestrictionendonucleases 核酸上的磷酸二酯键的水解作用比氧还性断裂更为可取 因为在水解反应中全部信息得以保存 而在糖环的氧还性断裂中 产生糖环碎片并释放出碱基 但与水解反应不同 氧还性切割的碎片很难再被无损失地连接起来 19 水解作用的机理 金属离子能够有效地促进磷酸二酯键的水解 因为它们可以作为Lewis酸极化磷 氧键以促进其断裂 还可以运送亲核试剂 使形成五配位的磷酸基中间物 Sargeson等人发展一个机理模型体系 如下图 并已作了晶体学表征 在此体系中 磷酸二酯模型化合物的水解作用由于与Co II 配合物相结合明显快 这得益于配合物兼有酸性及亲核特征 20 Sargeson等人发展一个机理模型体系 磷酸酯被双核模型配合物水解 其中一个金属离子起Lewis酸作用 另一个起运送已配位的氢氧基的作用 21 金属离子及其配合物催化的水解反应 Ru DIP 2Macro是一种钌配合物 其中部有一个DNA结合域 Ru DIP 3 2 连接着两个用来螯合加入的Zn2 离子胺臂 可到达糖环骨架并促进DNA链水解切割 22 Barton等进行了用Ru DIP 2Macro加Zn2 Cd2 或Pd2 对双链DNA切割作用的实验探索 但效果不佳 在该系统中 分子的中间部分由Ru II 连接在一起 负责与DNA的结合作用 接在已经配位饱和的钌配合物上的是2个二亚乙基三胺功能团 接在Macro配体上 它们与具有水解活性的金属离子如Zn II 与Co II 发生配位 体系一旦由DNA结合域运送至糖 磷酸骨架 即促进水解作用的发生 23 Eichhorn在30多年前就发现 某些简单的金属离子如Zn2 Pb2 能促进RNA的水解作用 下图示出了tRNA被铅离子定位水解的情形 并已获得晶体结构表征的确认 在tRNA中 Pt II 占据了三个特异性的高亲和性结合点 在其中一个位点上 金属离子的存在促进了链的断裂 结合了Pb II 的晶体结构表明 与铅配位的氢氧根离子使一个残基糖环的2 羟基去质子 生成的2 氧为亲核试剂 会进攻磷酸基并生成一个五价的中间物 然后进一步变成2 3 环状磷酸基 重新结合质子后生成5 羟基 这种颇具特性的切割反应已被生物学家用作工具 用来探测突变tRNA的结构 因为反应对于核酸残基 磷酸骨架及所结合的金属离子在空间的排布极为敏感 24 金属离子及其配合物催化的水解反应 铅离子对DNA的定位水解 在建议的机理中 糖环 磷酸骨架的切割在酵母tRNAphe中发生于D17与G18残基之间 25 可与核酸发生结合作用的金属配合物的应用 利用过渡金属配合物的光谱特征及其化学反应性能 再结合生物学技术 可进行核酸结构与功能的研究 光谱探针由于金属配合物 如三 菲咯啉 为配体 插入DNA的双螺旋中时发光性质发生很大变化 所以为核酸的结构研究提供了一种新的光谱探针方法 26 光谱探针 在DNA荧光光谱实验中 金属配合物作为一种简单的发光染色剂 同时三 菲咯啉 钌衍生物具有构象选择性 如 Ru DIP 3 3 DIP 4 7 二苯基 1 10 菲咯啉 表现出对B DNA的对映体具有选择性 由于苯环的空间效应 右手螺旋中只与 异构体有可测的结合作用 而 异构体则否 但对于左手螺旋的Z DNA 两种异构体都能与之结合 Z DNA上较浅的左手大沟对两种对映体产生容纳 但对 异构体表现出更大的选择性 因此 对于某种给定的DNA 考察 Ru DIP 3 3 各种对映异构体对它的结合作用 由光谱测定可确定所给DNA的手性性质 事实上 Ru DIP 3 3 是首例Z DNA光谱探针 27 核酸的两个光谱探针的结构示意图 28 核酸光谱探针的发光原理 在金属配合物中 金属向配体的电荷转移优先向具有电子接受能力的配体dppz进行 该配合物在非水溶液中发光 而在水溶液pH7条件下却观察不到发光 可能是由水到吩嗪氮间的氢键作用使荷移激发态猝灭 dppz是一个跨度较大的芳香环配体 这使得 Ru bpy 2dppz 2 能有效地插入DNA中 一旦被插入 吩嗪配体即受到保护 不接触水 因此配合物在插入DNA后发光 而在水溶液中无DNA时不发光 此例中的DNA发光增强因子大于104 可以认为 对于DNA来说 这类钌配合物是真正的 分子光开关 molecularlightswithches 29 2 金属足迹图谱试剂 测定DNA一级结构的足迹图片法实验方法 设想研究某种金属配合物对长度为100bpDNA片段的切割反应来确定其碱基的序列 须先用酶学方法对一股的一端进行32P标记 假如该金属配合物会在几个不同位点切割DNA 那么会碰到这样的结果 即可能的几个切割不是同时发生在一个分子上 而是相当于每一条链上出现一个切口的片段 30 实验方法 3 将切割片段作变性处理 用高密度聚丙烯酰胺中的凝胶电泳 high densitypolyacrylamidegelelectrophoresis 并进行放射自显形 autoadiography 结果只有那些作了放射性标记的片段才可被测出来 同时也就测定了某种片段的长度 4 变性处理后的切割片段在凝胶中的移动性依其分子量的大小而异 利用分子量标记可测出各片段的长度 于是就找到了各断裂位点 31 足迹法 footprinting 如果选用的金属配合物其切割断裂是非选择性的 即沿着片段的所有位点都发生断裂 这就是所谓的足迹法 footprinting 利用足迹图片对比方法 能够确定其他分子如DNA结合蛋白质的结合位点 原理如下 足迹法中采用无序列选择性的切割试剂 并分别做结合分子存在与不存在条件下的切割实验 当无结合分子存在时 断裂发生在一切可能的位点 于是放射自显形图片是一个明显的切割片段的梯格 ladder 对应于各种不同长度 而有结合蛋白存在时 被蛋白结合了的位点由于受到保护不被切割 在放射自显形的凝胶电泳图谱上得到的缺少某些梯格的不同图谱 32 定位切割和足迹实验的说明示意图 33 金属配合物对DNA的切割 实验方法可达到单碱基分辨的能力 金属配合物结合于经放射性末端标记 的DNA片段的几个结合位点并激活后 引起结合处的链切割 切割后的DNA经变性处理 作高分辨的聚丙烯酰胺凝胶电泳 然后作自显影 从具有不同分子量的末端标记变性片段的电泳特征 可以推测断裂位点 即原来金属配合物的结合位点 凝胶电泳谱图上的A列示出金属配合物在特定位点结合并断裂DNA B是非特异性结合因而可在每一碱基位点切割DNA片段 C列说明了足迹图谱实验 当蛋白质结合于DNA上特定位置时 它对DNA上的结合位点起保护不被切割的作用 由此产生了一个 足迹 由于受到保护 相当于被保护长度的末端标记片段在电泳图上不出现 34 金属离子对生物分子的折叠和交联作用 金属离子可以充当构筑生物分子三维结构的模板 templates 金属离子在同蛋白质的位点相结合时往往要失去若干原来与其配位的水分子 而当与核苷酸 核酸相互作用时 配位水分子通常被保留 并且有助于形成一定的结构 由金属结合作用诱发的三级结构能够促进大分子之间的相互作用 交联的形成对于某些无机药物的作用机理也很重要 35 金属离子对蛋白质结构的稳定作用 天冬氨酸转氨甲酰酶 aspartetranscarbanoylase ATCase 天冬氨酸 N 氨甲酰磷酸氨甲酰天冬氨酸 磷酸该反应是嘧啶生物合成的第一步 这个酶是变构调节的 加入该生物合成途径的终产物CTP 胞苷三磷酸 能减小酶的活性 而加入ATP则增加酶的活性 下图示出了这种变构作用 allosterism 即蛋白质亚基之间由于结合了底物或其他外源分子而触发的相互协作性 cooperativity 或反协作性 anticooperativity 催化 36 天冬氨酸转氨甲酰酶活性与变构效应物CTP及ATP的关系图 在给定的天冬氨酸浓度下 CTP抑制酶的活性 而ATP促进酶的活性 37 天冬氨酸转氨甲酰酶 ATCase 的结构 ATCase全酶相当大 总共由12条多肽链组成 含6个催化亚基 各亚基含302各氨基酸残基 另有6个调节亚基 每个亚基含154个氨基酸残基 四极结构的部分破坏可导致催化单元与调节单元的分离 催化链形成三聚体 而调节链形成二聚体 其上由供抑制剂和激活剂如CTP和ATP结合的位点 全酶总共含有6个锌离子 每个调节亚基中含有一个锌离子 38 天冬氨酸转氨甲酰酶 ATCase 的结构 a 俯看三重对称轴 b 沿一条二重轴看 结合态的锌离子对调节及催化亚基之间的相互作用而形成的结构域起稳定作用 39 天冬氨酸转氨甲酰酶 ATCase 的结构 ATCase的三维结构已用x射线晶体分析方法进行测定 天然酶的整体结构如上图所示 整个结构含2个催化三聚体 按三重轴排列 还有桥联的3个调节二聚体 沿着与三重轴相垂直的三条二重轴排布 分子整体具有D3对称性 调节链由两个结构域组成 N 端的90个A A 形成一个结构域 与二聚化及变构作用有关 C 端的60个氨基酸残基形成另一个结构域 围绕一个Zn2 以4个半胱氨酸 Cys 残基配位构筑此结构域 锌结构域与调节亚基及催化亚基直接接触 40 ATCase酶变构行为的可能机制 ATCase酶的这种变构行为由Monod Wyman和Changeux首次用T态 R态的模型给予解释 这一模型显示 该酶能以两种形式的四级结构存在 一种是紧密型即T态 tensestate 它只含有很低的底物亲和性 另一种是松驰型即R态 relaxedstate 它含有很高的亲和性 这种状态下抑制剂的效应将促使平衡向T状态发展 而活性剂的效应促使平衡向R状态发展 41 ATCase酶变构行为的可能机制 锌在促使ATCase酶变构行为中的重要性已通过几种方式被证明 化学修饰的研究已揭示锌的去除将导致调节亚基与催化亚基的解离 大约酶修饰24个半胱氨酸将引起6个锌离子从全酶中释放 用超滤法已测出这一过程将引起该酶解离为催化三聚体亚基和调节二聚体亚基 只有当加入锌时 半胱氨酸化汞加和物裂解产生的过量巯基才会引起调节亚基的蛋白部分重新与催化亚基配位结合 这一实验有力地提示了调节结构域的锌 半胱氨酸配合物的存在 这个结构稍后即被晶体学研究所证实 42 核酸结合蛋白中的锌指结构 锌指蛋白最先发现于转录因子IIIA transcriptionfactor TFIIIA TFIIIA是一个位点特异性的DNA结合蛋白 它在调控非洲爪蟾蜍的5SrRNA基因转录中起着决定性作用 这一蛋白中锌的作用已由以下两个实验路线所证实 从爪蟾蜍卵母细胞中分离的蛋白作为5SrRNA配位的一部分被发现含有2 3个等价的锌离子 在用TFIIIA 5SrRNA配合物对含螯合剂EDTA的溶液作透析时发现这些锌离子并不会失去 但是 一旦在透析前先用RNA酶处理以破坏RNA 则这些锌离子可被透析除去 43 核酸结合蛋白中的锌指结构 2 实验证明这些结合的锌离子对于DNA的特异结合是至关重要的 从5SrRNA配合物中分离出的TFIIIA 如果含有锌离子 那么它可以和一段约含45个碱基对的DNA片段结合并且可以保护这一片段免受核酸酶的降解 但是 一旦通过EDTA的螯合作用去除锌离子 则这种特异结合作用也就丧失了 此时若补加锌离子 这种活性又可恢复 但加其他相同浓度的离子 如Co2 Ni2 Fe2 Mn2 则并没有这种效果 44 核酸结合蛋白中的锌指结构 根据cDNA 为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDNA之缩写 的核酸序列分析推演出的FTIIIA氨基酸序列 人们提出这些蛋白依赖锌离子的DNA结合模式 在序列靠近N端3 4的位置上发现了9个连续的序列 它们都含有大致相同的结构 Tyr Phe X Cys X2 4 Cys X3 Phe X5 Leu X2 His X3 4 His X2 6其中X代表可以变化的残基 该序列中含有2个半胱氨酸和2个组氨酸 它们都具有能够螯合锌离子的侧链 这9个序列中的每一个都围绕着锌离子而形成一个结构域 其中的锌离子是与半胱氨酸和组氨酸螯合在一起的 这些结构域被称为锌指结构 45 zinc fingerStructure 46 ZinccontainingDNA bindingdomains 47 某些代表性锌指蛋白的结构示意图 图中示出含锌指结构域的数目以及它们在蛋白质的一级结构中的相对位置 48 金属离子对核酸结构的稳定作用 Mg2 对转移RNA tRNA 的折叠作用金属离子对RNA结构的稳定化作用已作了许多研究 某些金属离子的结合位点已在酵母苯丙氨酸tRNA上得到确定 其中最主要的稳定作用位点是由Mg2 占据的一个位点 此位点也可由Mn2 占据 但结构有所不同 溶液中的结构稳定化测定表明 此位点在D及T环附近 由x射线晶体学推出的Mg2 位点分结构如下图所示 49 酵母tRNAphe在Mg2 结合位点的结构 50 蛋白质上的金属结合位点与核酸上的金属结合位点之间的差别 在蛋白质中 金属离子几乎或完全地水化 即原来结合的水分子要移去 由蛋白质上氨基酸充当配体取而代之 而对于tRNA上的结合位点 或许是对一切核酸也同样 来说 绝大多数的水化分子仍然保持配位状态 只有一个或两个来自核酸的配位点与金属离子直接结合 不过 由水分子占据的配位点对于结合的特异性仍然是重要的 因为它们参与同核酸上的磷酸基或其他基团形成氢键 51 金属离子在催化性RNA分子中的作用 近年来生化领域最令人激动的发现之一就是某些RNA分子可以作为生化反应的催化剂 业已确定了几种催化性RNA分子 有时也称为核酶 ribozymes 通过对核酶的功能研究和结构表征得知 其中的金属离子在两个方面起作用 即金属离子对RNA分子的折叠结构起稳定化作用 同时也参与催化作用 来自四膜虫属嗜热菌RNA的自剪接内含子 self splicingintron 就是一个例子 52 核糖核酸酶P RNaseP 的发现 1980年代 托马斯 切赫 ThomasCech 和雪梨 奥尔特曼分别从四膜虫的rRNA前体的加工研究和细菌的核糖核酸酶P RNaseP 复合物的研究中都发现RNA本身具有自我催化作用 并提出了核酶的概念 这是第一次发现蛋白质以外的具有催化活性的生物分子 1989年 其二人也因此获得诺贝尔化学奖 53 四膜虫属嗜热菌RNA的自剪接内含子与Mg2 的结合作用 在无Mg2 存在时 该RNA分子是非活性的 但在加入浓度为1mmol L的Mg2 或Ca2 时 可使RNA完全折叠且不被切割 其稳定和完整程度几乎与无折叠三级结构的RNA一样 但Ca2 配合物 虽然折叠完全程度与Mg2 配合物相同 却无催化活性 加入Mg2 后 Ca2 配合物即产生活性 由此看来 只有Mg2 才能折叠RNA并激活核酶 54 四膜虫属嗜热菌RNA的自剪接内含子与Mg2 的结合作用及人们提出的结构 55 金属离子和配合物与生物分子活性中心的结合 生物分子能够根据金属离子的电荷 半径 易变性 软硬度 在Irving Williams序列中的位置 配体和其他配位优选以及生物利用率选择金属离子 有些体系很明显是受热力学控制的 而在另外一些体系中动力学因素则显得更为重要 当与生物高分子如蛋白质和核酸结合时 形状选择性被用来区分彼此相关的但在立体化学上不同的金属配合物 特殊的酶可以通过改变受体的形状使其易于配位 从而克服金属离子插入到配位位置时的动力学势垒 由于大多数情况下 金属结合位置都被蛋白质所覆盖 所以整体常常为电中性 配体质子化或去质子化平衡在维持电荷平衡方面起着重要作用 56 金属离子对蛋白质位置的选择和插入 热力学控制Example 早期关于锌指蛋白的金属离子在TFIIIA转录因子中的研究表明 加入Zn2 能激活已用EDTA处理过的蛋白 而其他金属离子如Co2 Ni2 Fe2 Mn2 在相近浓度下不能恢复蛋白质的活性 问题在于 金属离子在蛋白质中对半胱氨酸和组氨酸结合位置的亲和力的差别能否解释这一现象 57 锌指蛋白的热力学稳定性研究 利用直接光谱测定具有各种各样金属离子的一个单锌指肽配合物的解离常数 离解常数分别为 Zn2 2 10 12mol L Co2 5 10 8mol L Ni2 2 10 6mol L Fe2 3 10