唾液中提取RNA的操作规程.doc

唾液中提取RNA的操作规程Omega试剂盒法1 目的规范从唾液中提取RNA的方法和过程。2 范围适用于人唾液的RNA提取。3 实验仪器3.1 高速冷冻离心机：Neofuge 13R，Neoguge 15R3.2 Extragene mini centrifuge；3.3 干式恒温器：K30，杭州奥盛；3.4 旋涡混合仪：XW-80A，QILINBEIER。3.5超微量核酸分析仪：Nano 2004 实验试剂、耗材4.1 DEPC Water(DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。 DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系)4.2 RNA-free Water4.2 氯仿4.3 无水乙醇，70%乙醇（用DEPC处理水配制）；4.4 Omega的血液RNA小量提取试剂盒；4.4.1 用灭菌水稀释10x Buffer ERL到1x Buffer ERL4.4.2 RNA Wash Buffer 在使用前，按瓶子标签所示用无水乙醇进行稀释。5 实验流程5.1 口腔脱落细胞的收集5.1.1 取干净的口腔拭子在口腔壁上来回筛拭20-30次左右，然后小心地将拭子头掰断，并放入有保存液的1.5ml的无酶离心管中。5.1.2 将离心管放到掌式漩涡机中充分震荡1min。5.1.3 12000rpm室温离心1min。5.1.4 去上清，加500ul的DEPC Water进行洗涤，混匀，12000rpm室温离心1min。5.1.5 重复步骤5.1.4，最后用200ul的DEPC Water对沉淀进行悬浮。5.2 消化裂解细胞5.2.1 加入1ml RNA-Solv Reagent,2ul RNA酶抑制剂,充分混合均匀，室温静置10min。5.2.2 加入250ul的氯仿，（每1ml RNA-Solv Reagent加250ul氯仿），剧烈震荡15s，冰浴10min。5.2.3 4，12000g离心15min。5.3 收集和纯化 RNA5.3.1 吸取不超过上清80%的上清液至新的2.0ml无酶离心管中（注意枪头不要碰到离心管壁或沉淀），并加入等体积的70%的乙醇至管中，混合均匀，静置2min。5.3.2 吸取800ul液体至离心柱中,静置2min。室温，10000rpm离心1min。5.3.3 掉弃废液，吸取剩下的液体至离心柱中，静置2min。室温，10000rpm离心1min。5.3.4 吸取300ul RWC Wash Buffer 至离心柱中进行洗脱，室温，12000rpm离心1min。5.3.5掉弃废液，吸取300ul RWC Wash Buffer 至离心柱中进行洗脱，室温，12000rpm离心1min。5.3.6 把离心柱放到干净的收集管中，吸取300ul RNA Wash Buffer 至离心柱中进行洗脱，室温，12000rpm离心1min。5.3.7 掉弃废液，吸取300ul RNA Wash Buffer 至离心柱中进行洗脱，室温，12000rpm离心1min。5.3.8 掉弃废液，把离心柱重新装回收集管中，室温，12000rpm离心3min。5.3.9 把离心柱转移到干净的1.5ml无酶的离心管中，打开盖子，室温静置2min， 让残留的乙醇充分挥发。5.4 洗脱收集RNA 5.4.1 加入1530ul 已56预热的RNA-free Water至柱子的膜中央，室温静置35min。12000rpm离心1min。5.4.2 再进行一次挂柱，然后掉弃离心柱。5.5 RNA 浓度检测5.5.1