Biacore 实验步骤.doc

L、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质RAMc通过伯氨基与CM-5传感芯片表面的结合1将CM-5传感芯片模块嵌入BIAcore仪器。2全部采用过滤并除气的HEPES缓冲盐溶液。3将分别含有NHS、EDC、乙醇胺和RAM Fc以及20 mmol/L HCl各100l的小管置于BIAcore自动进样器架的适当位置。4将一个空管置于BIAcore自动进样器架上。5开动仪器，以5l/min的流速流过一个流动池。6将75l的NHS加入到一个空管中。7在同一个管中再加入75l的EDC。8将含有NHS和EDC的小管中的成分混匀。9注射35l NHS/EDC混合物使表面活化。10(放置一个基线报道点)注射35lRAM Fc到活化表面与抗体结合。11注射35l乙醇胺使过量的反应基团失活。12快速注射10l的20 mmol/L HCL，然后用Extraclean除去非共价结合型材料。13通过在开始注射RAMc前放置一个基线报道点，并在注射20 mmol/L HCl结束后2 min放置第二个报道点，来测定结合RAMc水平。14关闭流动液，关闭命令窗口，保存报道文件。检测抗-TSH与RAMc表面的结合15开动仪器，使含有结合RAMc的流动池流速为10l/min。16注射10l的2g/ml抗-TSH。17快速注射10l的20mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。18为了测定结合到RAMc表面的重现性，用可以与抗TSH结合引起250 Rus所需的体积重复注射抗TSH。19快速注射10l的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。20关闭流动液体，关闭命令窗口，保存报道文件。检测TSH与捕获抗-TSH表面的结合21开动仪器，使含有结合RAMc的流动池的流速为10l/min。22注射10l的2g/ml抗-TSH。23注射25l的200 nmol/L TSH，限定120 s的解离时间。24快速注射10l的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。25关闭流动流，关闭命令窗口，保存报道文件。四、实验步骤1、spreconcentration （预结合试验）由于芯片表面带有负电，因此要偶联到芯片上的分子必须带上正电，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共价偶联反应的完成。预结合实验就是将样品溶解在不同PH值的缓冲液中，使其带上不同量的电荷。然后，将样品流过芯片表面，观察它与芯片的结合曲线，就可判断出合适的条件。如下图：两种不同条件下的吸附实验，第一个峰表明在该条件下，吸附很快达到饱和，这样吸附的量有限，第二种一直呈上升趋势，有利于在芯片上偶联较多的蛋白。实际工作中，还会碰到各种不同的吸附曲线，需要根据实际情况来判断最佳条件。将抗体用不同PH值的buffer稀释1040倍，以5l/m的流速流过芯片表面，观察抗体与芯片的吸附结果。2、偶联 X9 P! s) E( I( v! Ha)取100lNHS和100微升EDC混合，12000rpm离心5分钟；b)取一定体积的偶联蛋白，按预结合的比例稀释，稀释后需要150l，取100l ethanolamine HCL。以上试剂平衡到室温25摄氏度左右，高速离心五分钟；c)将上述三种试剂放在样品架上，设定加样流速为10l/min ，inject方式进样，NHS/EDC,样品，ethanolamine-HCl分别上样100，100，和60l。d)结束即可得到类似下图的曲线。 3、 结合将抗原用合适的缓冲液稀释成适当浓度，离心后上样，观察抗原抗体结合过程。如果需要测量不同条件下的结合状况，可以在一次进样结束之后，对芯片进行再生。然后再上下一个样品。/ V5 l+ k9 R: J$ Q; U 4、芯片再生- 抗原抗体结合的再生条件比较简单，简单地用PH2.5的10mMglycine冲洗就可以了。但实际工作中，如果偶联的是蛋白，往往情况要复杂得多。首先,再生条件要能将结合物从芯片上去掉，其次不能让结合在芯片上的蛋白变性失活。因为，万一所选条件使芯片上偶联的蛋白失活，这个通道就意味着报废。所以，芯片的再生是所有用户面临的一个比较头疼的问题。芯片再生要求再生之后，不仅要求基线要能回复到初始值，还要求再上相同的样品，结合能力不会出现明显下降。5、如果需要得到结合与解离的动力学常数，至少需要进行五组不同浓度的结合实验。6、分析实验结果