结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛课件

刘军博士加拿大多伦多大学医学遗传和微生物系终身教授多伦多大学肺结核和艾滋病研究中心主任加拿大McLaughlin分子医学中心科学家加拿大国立卫生研究院研究员中国国家自然科学基金国家杰出青年 海外 成都永安制药有限公司研发总监 结核诊断新技术的理论探讨 世界结核病疫情 目前全球1 3的人口 约20亿 已经感染了结核菌 每一秒钟就会产生一位新的感染者 如不控制 近10年将有3亿人受感染 全球有2000万人患结核病 每年新发病人数达800 1000万人 全球每年约300万人死于结核病 与艾滋病 疟疾并列为影响全球健康的三大传染病杀手 与艾滋病形成致命的交叉感染 30 的HIV携带者死于结核 耐药结核在全球的出现和持续增加 20 严重威胁目前结核的有效治疗 我国结核病疫情 中国结核病患者数量居世界第二位 每年因结核病死亡的人数大大超过其他传染病死亡人数的总和 且中国人群结核分枝杆菌感染人数达到5 5亿 卫生部副部长王陇德2006年新闻会客厅语 我国结核病疫情 我国2003年对结核病的治愈率平均已达到87 以上 但对结核病的发现率约为29 发现率极低已成为我国有效控制结核病大规模传染的最大障碍和隐患 世界卫生组织已向我国明确提出 要求尽快将结核发现率提高到70 以上 结核病传统的常规诊断方法 结核病诊断方法现状 菌阳肺结核病诊断 痰涂片 痰培养方法 敏感性 检出率 低 时间长 肺外结核 排细菌较少的结核病人诊断困难 几乎很难检测到菌阴肺结核病诊断 皮下结核素 X 光方法 病理综合诊断 敏感性 检出率 低 特异性差 假阳性高同时使用以上四种诊断方法对疑似病人进行筛选 在中国的发现率低于30 全球目前对于菌阴结核的诊断没有有效和统一的方法和标准 而菌结核可占结核病人的60 70 结核病诊断方法发展趋势 目前国际学术界正竭力寻找 特异性高的结核分枝杆菌抗原结核分枝杆菌特异性靶位DNA序列以便作为免疫诊断或分子生物学诊断的基础 为准确诊断结核病提供依据 国际市场现有分子生物学诊断试剂 国际市场上PCR试剂盒的主要缺陷 操作复杂 由于所选用的靶位基因特异性差 需要多步骤的操作 检测的基因对象特异性差 许多不同的靶位序列包括DNA和RNA片断被推荐使用 但最普遍的是16S核糖体 ribosomal DNA rDNA 16S核糖体RNA rRNA 和IS6110重复片断 这些基因片断的特异性差 价格昂贵 虽然Gen Probe公司的AMTD和Roche公司的AMPLICOR早在1996年已被美国FDA批准上市 但是这些试剂盒在包扩美国在内的发达国家医疗机构中的推广应用却很有限 其最主要原因是它们的价格昂贵 Dowdy等人在美国医院所作的研究表明 Gen Probe公司AMTD试剂盒用作痰涂片阳性病人诊断的最低费用为338美元 每人 而用作早期排除病例 根据AMTD阴性结果判断 的费用为494美元 每人 Dowdy等人更进一步比较了治疗结核病人的费用 201美元 每人 并得出结论 AMTD试剂盒不是经济实效 costeffective 的手段 可想而知 这些诊断试剂在结核病高发的发展中国家的推广应用更为有限 国际现有血清免疫诊断试剂 现有血清诊断方法的缺陷 其他选用抗原 14kDa MPT63 19kD MPT64 MPT51 MTC28 A85B KatG Esat 6等灵敏度不够高 12 58 尤其是菌阴病人容易产生假阳性 所选用的抗原在非结核分枝杆菌 尤其是环境中的分枝杆菌 environmentalmycobacteria 中也存在 从而导致交叉反应 MycobacteriumGenus 分枝杆菌属类 包括 85个种 Mycobacteriumspecies 人类致病菌 肺结核分枝杆菌 M tuberculosis 牛型分枝杆菌 M bovis 通称为M tbcomplex麻风分枝杆菌 M leprae 机会感染菌 免疫能力低下者感染M avium intracelluarecomplex MAC M marinum M fortuitum M ulcerans M terrae M kansasii M genavense M chelonae M xenopi M abscessus环境中的分枝杆菌 占大多数 不引起疾病M smegmatis M vaccae M aurum 诊断检测对象 靶位 S T Cole etal Nature 1998 393 537 544 结核分枝杆菌H37Rv基因组 4 039个基因 ORF 分枝杆菌基因组测定 M tuberculosisCDC1551 4237基因M bovis 3970基因M bovis BCGPasteur 4004基因M leprae 1655基因M avium 5170基因M paratuberculosis 4398基因M marinum 5485基因M ulcerans 4210基因M gilvum 5296基因M vanbaalenii 6037基因M smegmatis 6770基因Mycobacteriumsp KMS 5527基因Mycobacteriumsp JLS 5796基因 致病菌 环境中的分枝杆菌 非致病菌 PresenceofIS6110isvariableinclinicalstrains Moatter T etal 1998 DetectionofMycobacteriumtuberculosisinparaffinembeddedintestinaltissuespecimensbypolymerasechainreaction characterizationofIS6110negativeStrains J Pak Med Assoc 48 174 178 IS6110isabsentinsomeclinicalstrainsofM tuberculosis Vansoolingenetal 1993 ComparisonofvariousDNArepetitiveelementsasgeneticmarkersforstrainDifferentiationandepidemiologyofM tuberculosis J Clin Microbiol 31 1987 1995 M tuberculosisCDC1551 4237基因M bovis 3970基因M bovis BCGPasteur 4004基因M leprae 1655基因M avium 5170基因M paratuberculosis 4398基因M marinum 5485基因M ulcerans 4210基因M gilvum 5296基因M vanbaalenii 6037基因M smegmatis 6770基因Mycobacteriumsp KMS 5527基因Mycobacteriumsp JLS 5796基因 致病菌 环境中的分枝杆菌 非致病菌 TB SA抗原存在 TB SA抗原不存在 TB SA基因 蛋白具有技高的特异性 血清诊断的理想抗原 TB SA蛋白抗原 TB SA具有极高的特异性 只存在于结核分枝杆菌 Mycobacteriumtuberculosis 和与其紧密相关的同类致病菌中 TB SA基因的表达 只有在结核杆菌侵入人体巨噬细胞 macrophages 内才发生 排除接种卡介苗的人群对实验结果的影响 有效控制假阳性 TB SA抗原蛋白是一种分泌性蛋白 容易被机体识别并引起免疫应答从而产生特异性抗体 是结核分枝杆菌血清诊断的理想抗原 PCR检测的理想对象 TB SA基因 TB SA基因只存在于结核分枝杆菌和其它几种致病的分枝杆菌中 具有极高的特异性 可以避免由非致病的分枝杆菌和其它不相关细菌而引起的交叉反应 TB SA基因是结核杆菌染色体上的基因 不是移动子 因此在所有的结核分枝杆菌菌株中都稳定存在 TB SA同源基因的DNA序列不完全一致 因此可以通过设计引物而检测DNA序列有差别的片段将结核杆菌从其它分枝杆菌中区分出来 CYPCO试剂的研究基础 在上述研究的基础上与成都永安制药有限公司成功开发出结核分枝杆菌抗体 IgG 检测试剂盒 酶联免疫法 结核分枝杆菌 TB SA 核酸扩增 PCR 荧光检测试剂盒 CYPCO试剂的临床研究 临床研究单位 多中心北京结核病胸部肿瘤医院 组长单位 山东省胸科医院成都市结核病防治院临床研究考核方法 采用双盲法临床考核对象细菌学检查及临床诊断为结核病患者 菌阳 菌阴 肺外结核 细菌学与临床诊断为非结核病的呼吸系统疾病或肺癌患者 无肺部疾患的健康志愿者 临床研究样本量远远大于国内外文献中所报道的临床试验 入选病例分布 结核分枝杆菌抗体 IgG 检测试剂盒 酶联免疫法 临床应用考核 包括健康人群和其他肺部疾病 健康人群特异性 86 4 其他肺部疾病特异性 80 2 结果分析 结核分枝杆菌抗体 IgG 检测试剂盒 酶联免疫法 临床应用考核 20mm TB SAELISAnotinfluencedbyPPDreaction P 0 98betweendataof 20mm 结核分枝杆菌抗体 IgG 检测试剂盒 酶联免疫法 临床应用考核 结核分枝杆菌抗体 IgG 检测试剂盒 酶联免疫法 临床应用考核提高了菌阴结核病及肺外结核病的检出率 结论 对菌阴肺结核和肺外结核诊断价值高 与传统的涂片法和培养法比较 该方法明显提高结核病的阳性检出率 具有统计学意义 操作简便 快速 价格低廉 无需特殊仪器 适合基层医院 可作为临床结核病诊断和鉴别诊断的辅助手段 TB SAELISA试剂盒对结核病人的诊断不受患者PPD反应的影响 这对在卡介苗广泛推广的高危地区的推广应用有积极意义 结核分枝杆菌抗体 IgG 检测试剂盒 酶联免疫法 临床应用考核 入选病例分布 结核分枝杆菌核酸扩增 PCR 荧光检测试剂盒临床应用考核 结果分析 结核分枝杆菌核酸扩增 PCR 荧光检测试剂盒临床应用考核 对涂片 培养漏检标本的高检出率850例结核病人PCR 培养 涂片阳性检出率比较 结核分枝杆菌核酸扩增 PCR 荧光检测试剂盒临床应用考核 高特异性 有助于临床诊断和鉴别诊断 结核分枝杆菌核酸扩增 PCR 荧光检测试剂盒临床应用考核 赛普克CYPCO结核分枝杆菌核酸扩增 PCR 荧光检测试剂盒 高灵敏度 检测限度可达到10菌 ml 可以检出约2 3涂片 培养漏检标本 有助于菌阴肺结核及肺外结核诊断与鉴别诊断 高特异性 仅检出致病结核菌 对非致病结核杆菌和其他非结核杆菌的检测保持良好的阴性结果 防污染 完全闭管扩增和检测 有效地防止了PCR扩增产物的污染 避免假阳性结