最详细crisprcas9系统原理应用及发展课件

CRISPR Cas9系统基因修饰理论与实战 1基因表达研究方法 干扰基因表达 过表达或低表达 或者表达突变体并检测其相关生理功能 是基因功能研究中最重要的方式之一 基因表达技术 质粒转染 病毒转染等传统方法得到广泛运用 但同时其也存在缺点 1基因修饰的方法与各自优势 质粒 瞬时转染 某些细胞效率偏低 表达结果不稳定 有内源表达的干扰 质粒 稳定细胞 表达结果不稳定 筛选效率不高 在重组插入基因组中可能干扰其它基因表达 病毒 瞬时感染 表达结果不稳定 质粒容易在细胞复制过程中丢失 随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达 新一代的基因编辑技术 利用重组酶在基因组水平修饰基因 产生的遗传性质稳定 直接作用于内源 减少表达干扰 目前有成熟的技术如CRISPR Cas9 DNA NHEJandHDR DNA修复的机制与基因编辑原理 非同源性末端接合修复机制 Non homologousendjoining NHEJ 同源介导的修复机制 Homology directedrepair HDR 5 ZFNandTALEN ZFN与TALEN基因编辑原理 6 LeC FAnnR DavidC etal 2013 Science 6121 819 823 GenomeEditinginMammalianCells 1CRISPR Cas概述 CRISPR Cas 一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术 CRISPR Cas主要由两部分组成 识别 切割 1CRISPR Cas概述 1 1CRISPR结构 CRISPR clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族 广泛分布于细菌和古细菌基因组中 CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列 repeats 组成 重复序列的长度通常21 48bp 重复序列之间被26 72bp间隔序列 spacer 隔开 CRISPR就是通过这些间隔序列 space 与靶基因进行识别 1 1CRISPR结构 1 2Cas家族 Cas CRISPRassociated 存在于CRISPR位点附近 是一种双链DNA核酸酶 能在guideRNA引导下对靶位点进行切割 它与folk酶功能类似 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用 2CRISPR Cas系统的发现 CRISPR Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统 通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别 利用Cas蛋白进行切割 从而达到对自身的免疫 2CRISPR Cas系统的发现 2CRISPR Cas系统的发现 2CRISPR Cas系统的发现 CRISPR Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫 而这种特异性是由间隔序列 spacer 决定的 在宿主防御噬菌体攻击中 针对自然界中庞大的噬菌体种群 细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫 这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化 即通过增加或删除间隔序列 spacer 来实现的 2CRISPR Cas系统靶向要求 最主要的要求 PAM protospacer adjacentmotif 为NGG 2CRISPR Cas系统靶向要求 在人类基因组中 平均每8bp就出现一个NGGPAM 2CRISPR Cas系统靶向要求 3CRISPR Cas系统介导基因修饰 3 1dual RNA Cas介导编辑模板替换 2013年1月29日在 naturebiotechnology 上发表的 RNA guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR Cassystems 一文中 作者利用CRISPR Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰 3 1dual RNA Cas介导编辑模板替换 3 2sg RNA Cas介导基因修饰 2013年1月29日在 naturebiotechnology 上发表的 efficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR Cassystem 一文中 作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰 3 2sg RNA Cas介导基因修饰 3 2sg RNA Cas介导基因修饰 3 2sg RNA Cas介导基因修饰 Cas9 sg RNA 2013年2月15日在 science 上发表的 MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR CasSystems 一文中 作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑 3 3cr RNA Cas介导双基因修饰 3 3cr RNA Cas介导双基因修饰 4CRISPR Cas系统前景分析 这是一项靶向基因修饰的革新技术 一项极具有可能获得诺贝尔奖技术 4CRISPR Cas系统前景分析 2013年4月12日在 cellstemcell 上发表的 EnhancedEfficiencyofHumanPluripotentStemCellGenomeEditingthroughReplacingTALENswithCRISPRs 一文中 作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰 效率分别为0 34 和51 79 4CRISPR Cas系统前景分析 而且从实际应用的角度来说 CRISPRs比TALENs更容易操作 因为每一对TALENs都需要重新合成 而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行 4CRISPR Cas 只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰 Cas蛋白不具特异性 编码sgRNA的序列不超过100bp 因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便 较短的sgRNA序列也避免了超长 高度重复的TALENs编码载体带来的并发症 技术优势 5我们的工作利用CRISPR Cas9载体肿瘤基因M在卵巢癌细胞HeLa的编辑与敲除 流程 a sgRNA的引物设计 4条 b px459 cas9载体构建 HeLa细胞上的转染与基因靶点筛选 1次 c 母克隆的基因剪切的确定 2 3个母克隆 d 单克隆筛选 2 3轮 100个子克隆 f 单克隆的鉴定 Q PCR以及WB检测 母克隆8 31 M测序 子克隆8 31 12 d M测序 5我们的结果成功获得了M基因敲除的HeLa细胞系 模板CCCGGCAGGCTGGACAC TTCGTGGAGGGCTCCAAAG11 5 1CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 5 2CCCGGCAGGCTGGACAC GGAGGGCTCCAAAG 缺失6个碱基 不移码 11 5 3CCCGGCAGGCTGGACAC GGAGGGCTCCAAAG 缺失6个碱基 不移码 11 5 5CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 5 4CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 5 6CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 18 1CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 18 2CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 18 4CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG 插入1碱基 移码 11 18 6CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 18 8CCCGGCAGGCTGGACAC TCGTGGAGGGCTCCAAAG 缺失2个碱基 移码 11 18 9