生姜精油中姜烯的分离纯化.doc

山东大学硕士学位论文原 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名： 日 期： 关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名： 导师签名： 日 期： iii山东大学硕士学位论文目 录摘 要IABSTRACTIII第一章 文献综述11.1引言11.2生姜精油介绍31.2.1生姜精油的主要化学成分及应用31.2.2生姜精油的提取方法41.3姜烯概述61.3.1姜烯的性质61.3.2姜烯的应用价值61.3.3姜烯的分离纯化方法71.3.3.1硅胶柱层析法71.3.3.2分子蒸馏法81.3.3.3大孔树脂法91.3.3.4化学反应法101.4硅胶柱层析的原理与技术111.4.1硅胶柱层析的原理111.4.2层析柱的选择121.4.3柱层析装置121.4.4硅胶的选择121.4.5流动相的选择131.4.6待分离样品装柱151.4.7洗脱151.4.8硅胶柱层析的应用实例161.5国内外研究现状171.6本研究的目的、意义和内容181.6.1研究的目的、意义181.6.2主要研究内容18第二章 姜烯测定方法研究202.1姜烯测定方法现状202.1.1化学反应法202.1.2 紫外分光光度（UV）分析法212.1.3 气相色谱(GC)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析法212.1.4红外色谱法(IR)、质谱法(MS)和核磁共振法(NMR)222.2本研究拟建立的姜烯检测方法分析232.2.1薄层色谱(TLC)法232.2.2紫外可见分光光度(UV)法242.2.3气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析法252.2.4高效液相色谱(HPLC)法262.3姜烯测定方法的试验确定272.3.1试验仪器、试剂与材料272.3.2 UV分析条件的确定272.3.3 GC-MS分析条件的确定302.3.4 HPLC分析条件的确定332.4本章小结34第三章 硅胶柱层析法分离生姜精油中的姜烯353.1试验仪器、试剂与材料363.1.1 主要仪器与设备363.1.2原料与试剂363.2实验步骤363.2.1硅胶活化363.2.2 待分离样品的制备373.2.3 装柱373.2.4 洗脱剂洗脱373.2.5 UV、GC-MS和HPLC分析373.3结果与讨论383.3.1烯类和酚类成分的分离383.3.2烯类的精细分离403.3.2.1洗脱剂的确定413.3.2.2生姜精油与硅胶比例的选择423.3.2.3硅胶活化时间的影响433.3.2.4洗脱剂流速的影响443.3.3特征洗脱样品的分析453.3.3.1 UV扫描图453.3.3.2 GC-MS分析结果473.3.3.3 姜烯回收率的计算503.3.3.4HPLC分析513.4硅胶再生试验533.4.1已用硅胶的洗涤回收533.4.2一次回收硅胶分离生姜精油试验533.4.3二次回收硅胶分离生姜精油试验533.4.4 两次分离的UV分析结果533.5本章小结54第四章 硅胶柱层析法纯化姜烯554.1试验仪器、试剂与材料554.1.1 主要仪器与设备554.1.2原料与试剂554.2实验步骤564.2.1浓缩姜烯样品564.2.2硅胶活化564.2.3待分离样品制备564.2.4装柱564.2.5洗脱剂洗脱564.2.6 UV、GC-MS和HPLC分析564.3结果与讨论574.3.1分离条件的讨论574.3.2 GC-MS和HPLC分析574.3.3姜烯回收率的计算594.4本章小结60第五章 结论61参考文献63致谢66附录：硕士期间发表学术论文67山东大学硕士学位论文CATALOG The Chinese abstractIThe English abstractIIIChapter 1 Literature Review11.1 Introduction11.2 Ginger essential oil introduction31.2.1The main chemical composition and application of ginger essential oil31.2.2 Extractions of ginger essential oil41.3 Zingiberene overview61.3.1 The nature of zingiberene61.3.2 Zingiberene application value61.3.3 Separation and purifications of zingiberene71.3.3.1 Silica gel column chromatography71.3.3.2 Molecular distillation81.3.3.3 Macroporous resin91.3.3.4 Chemical reaction101.4 Principle and technology of silica gel column chromatography111.4.1 Principle of silica gel column chromatography111.4.2 Column selection121.4.3 Column chromatography equipment121.4.4 Silicone selection121.4.5 The mobile phase selection131.4.6 Preparation of sample separated151.4.7 Eluant151.4.8 Application examples of silica gel column chromatography161.5 Domestic and international research in present171.6 Content, purpose and significance of the research181.6.1 Purpose and significance of the research181.6.2 The main research contents18Chapter 2 Zingiberene detection methods research202.1 Zingiberene detection methods status202.1.1 Chemical reaction202.1.2 UV212.1.3 GC and GC-MS212.1.4 IR, MS and NMR222.2 The study aimed to establish detection methods of zingiberene232.2.1 TLC232.2.2 UV242.2.3 GC-MS252.2.4 HPLC262.3 Experimental determination of detection methods of zingiberene272.3.1 Test equipments, reagents and materials272.3.2 The determination of UV analysis conditions272.3.3 The determination of GC-MS analysis conditions302.3.4 The determination of HPLC analysis conditions332.4 Chapter summary34Chapter 3 Separation of zingiberene from ginger fssential oil by silica gel column chromatography353.1 Test equipments, reagents and materials363.1.1 The main instruments and equipments363.1.2 Raw materials and reagents363.2 Experimental procedure363.2.1 Silica gel activation363.2.2 Preparation of sample separated373.2.3 Column packing 373.2.4 Eluant eluting373.2.5 UV and GC-MS analysis373.3 Results and discussions383.3.1 Separation of olefins and phenolics383.3.2 The fine separation of olefins403.3.2.1 Determination of eluants413.3.2.2 The ratio selection of ginger essential oil and silicone423.3.2.3 The effect of activation time of silicone433.3.2.4 The effect of eluant flow rate443.3.3 Analysis of characteristic samples453.3.3.1UV spectras453.3.3.2 GC-MS analysis results473.3.3.3 Recovery calculation of zingiberene503.3.3.4 HPLC analysis513.4 Silicone regeneration test533.4.1The used silica gel washed for recovery533.4.2Separation of ginger essential oil by first recovery silica gel 533.4.3Separation of ginger essential oil by second recovery silica gel533.4.4UV analysis results of the two tests533.5 Chapter summary54Chapter 4 Purification of zingiberene by silica gel column chromatography554.1 Test equipments, reagents and materials554.1.1 The main instruments and equipments554.1.2 Raw materials and reagents554.2 Experimental procedure564.2.1 Concentration of zingiberene samples564.2.2 Silica gel activation564.2.3 Preparation of sample separated564.2.4 Column packing564.2.5 Eluant eluting564.2.6 UV, GC-MS and HPLC analysis564.3 Results and discussions574.3.1 Discussion of separation conditions574.3.2 GC-MS and HPLC analysis574.3.3 Recovery calculation of zingiberene574.4 Chapter summary60Chapter 5 Conclusion61References63Thanks66Appendix: Published paper during the masters period67vii摘 要本文以超临界CO2萃取的生姜精油为原料，依据其中的有效成分姜烯的结构和性质，采用硅胶柱层析对姜烯进行了初步分离纯化，并考察了相关因素对姜烯分离纯化的影响。首先，分析对比了分离目的物姜烯的分析检测方法。由于姜烯标准品难以得到，必须建立无参比物时的检测方法。通过对UV、GC-MS、HPLC结果的多次对照分析，确定了姜烯等烯类物质紫外区吸收峰的位置，其中姜烯的特征吸收峰为263nm。以此为基础，提出了采用UV、GC-MS和HPLC三种方法对姜烯进行定性、定量分析的方案：首先对样品在232nm和263nm波长下进行UV跟踪分析，对样品中的姜烯定性和初步定量，其次采用GC-MS分析，对姜烯样品进行准确定量，最后采用HPLC辅助分析。 其次，利用硅胶柱层析从生姜精油中分离姜烯。由于生姜精油中的烯类和酚类成分性质差别较大，首先对两者的分离进行探讨，得出当洗脱剂组成为乙醚：正己烷=7：3时可一次将两者依次分离。但是得到的烯类仍是含有较多成分的混合物，因而又将烯类进行精细分离，研究了洗脱剂组成、洗脱速度、固定相用量、固定相活化条件等因素对分离的影响，确定了最优分离条件为：洗脱剂中乙醚体积含量为3%，m(生姜精油):m(硅胶)=1:50，硅胶活化时间10min，洗脱流速为2.0ml/min。在此条件下，可分离出三类烯，对三类烯的峰值样品进行GC-MS分析，得到各峰值样品中的主要成分及其峰面积百分含量分别为：-水芹烯70.37%、姜烯60.41%、-姜黄烯34.17%，其中姜烯的回收率为70.68%。同时研究了硅胶回收方法，但分离效果与经济性都有待改进。最后，以上述最优条件下得到的姜烯样品为原料，利用硅胶柱层析对姜烯进行二次分离纯化，确定了姜烯纯化试验的条件为：洗脱剂中乙醚含量为3%，m(生姜精油):m(硅胶)=1:60，硅胶活化时间10min，洗脱流速为2.0ml/min，接样量为2.0ml/段。将纯化后姜烯峰值样品进行了GC-MS分析，结果姜烯峰值样品中的主要化学成分为姜烯和-倍半水芹烯，姜烯的相对含量从纯化前的60.41%提高到70.93%，同时将纯化后姜烯峰值样品进行了HPLC分析，得到的高效液相色谱图中只有一个峰，姜烯的纯度达94%。关键词：硅胶柱层析；生姜精油；姜烯；分离；UV；GC-MS；ABSTRACTZingiberene is one of biologic active components in ginger essential oil. In this article，zingiberene was separated and purified by silica gel column chromatography from Ginger essential oil extracted by supercritical CO2. The separation conditions and analysis methods of zingiberene were studiedFirstly, the analysis and detection methods of zingiberene were researched. As zingiberene standard material is hardly gotten, the detection method without reference material should be established. The process and main conclusion were shown as bellow. The zingiberene and other olefins UV absorption peakes were determined by comparative analysis of UV, GC-MS and HPLC analysis results. The characteristic absorption peak of zingiberene was at 263nm. The program of qualitative and quantitative analysis of zingiberene was proposed by UV, GC-MS and HPLC. Firstly, qualitative and preliminary quantitative results of zingiberene can be shown by UV analysis at 232nm and 263nm for all separation samples. Secondly, accurate quantification of zingiberene was got by GC-MS analysis for characteristic samples. Finally, HPLC was adopted to be as aided analysis.Secondly, separation of zingiberene from ginger essential oil by silica gel column chromatography was studied. Because of the nature of olefins and phenolics compounds in ginger essential oil vary greatly, the two were separated first. The olefins and phenolics could be separated by silica gel column chromatography at once when the eluant ratio between ether and hexane was 7:3. But olefins gotten was still a mixture. Fine separation of olefins was needed. The conditions of composition and rate of eluant, amount of stationary phase and stationary phase activation conditions have affection for separation result. The determined optimum separation conditions as follows: ether volume fraction was 5% of eluant, eluant flow rate was 2.0ml/min, m (ginger essential oil): m (silica) = 1:50, silicone activation time was 10min. Under these conditions, three kinds of olefins could be got. The main components of the peak samples of three kinds of olefins could be gained by GC-MS analysis. The peak area percentages of -phellandrene, zingiberene and -curcumene were 70.37%, 60.41 % and 34.17%, respectively. And the recovery of zingiberene was 70.68%. At the same time, silicone recycling method was researched. But the separation effect and economy of silicone recovery should be improved. Finally, zingiberene sample that obtained under the above optimum conditions was purified by silica gel column chromatography once again. The determined purification conditions as follows: ether volume fraction was 3% of eluant, m(ginger essential oil):m(silica)=1:60, eluant flow rate was 2.0ml/min, sample volume was 2.0ml/segment. According to GC-MS analysis, the peak sample of purified zingiberene mainly contained zingiberene and -Sesquiphellandrene. The relative content of zingiberene was increased from 60.41% to 70.93%. The HPLC was also chosen to analyze the peak sample of purified zingiberene. The high performance liquid chromatogram had only one peak and the purity of zingiberene could be 94%.Keywords: Silica gel column chromatography; Ginger essential oil; Zingiberene; Separation; UV; GC-MS.67第一章 文献综述1.1引言 姜，又称生姜、白姜、川姜、均姜，系姜科多年生宿根草本植物姜(Zingiber Officinale Rosc.)的根茎，是一种广泛应用的药食两用植物。原产于太平洋群岛，我国中部、东南部至西南部广为栽培，河南、山东、湖北、云南、广东、四川、江苏等省种植较多，著名的品种有安徽铜陵的白姜、山东莱芜的片姜、湖北来凤、黄冈的黄瓜姜、江西上高的白丝姜、广东疏轮大肉姜、贵州长顺生姜、四川成都的“蜀姜”、浙江义乌生姜等。据史书记载，早在周秦时代我国就有种植、食用和医用生姜的习惯。山东的莱姜就有2000多年的历史。论语乡党中记载有孔子“不撤姜食，不多食”的话。姜作为药用也有悠久的历史。管子地负篇中“群药安生，姜与桔梗、小辛、大蒙”的记载。伤寒杂病论中的112个药方中，用生姜配伍者达59个1,2。姜被广泛地用于烹调和食品的加香，姜精油、姜抽提物、姜油树脂等是食品工业广泛应用的香料。除此之外，姜也是一种传统中药，用于脾胃虚寒，腹痛吐泻，阳虚失血，临床药用多以复方为主。姜入药分为生姜、干姜两种。生姜味辛性温，长于发散风寒、化痰止咳，又能温中止呕、解毒，临床上常用于治疗外感风寒及胃寒呕逆等证，前人称之为 “呕家圣药”。干姜虽与生姜同出一物，但由于鲜干质量不同其性能亦异。干姜性热，辛烈之性较强，长于温中回阳，兼能温肺化饮，临床上常用于治疗中焦虚寒等症3。我国的生姜资源非常丰富，尤其近年来，各地相继大力引种生姜优良品种，扩大种植面积，使生姜年产量不断增加。姜也是我国传统的出口创汇农副产品之一，我国山东、广西、湖南、江西等地均有大量出口。但生姜的储藏较难，易腐烂变质，因此，每到收获季节，产区生姜损失很大。对生姜的综合利用研究，有利于原料的就地加工、储存运输。此外，迄今为止，生姜食用多作普通调味料，在我国一直以原姜或姜粉为主，利用率极低。近年来，虽有少量的姜精油生产，但提取后剩余的姜渣中大量有用成分都被丢弃，如代表生姜特征辛辣口味又呈多种重要生理活性的姜酚组分，在蛋白食品加工中极具潜力的生姜蛋白酶以及大量的纤维、淀粉、少量多糖、蛋白及矿物元素等等，造成生姜资源的浪费。因此，迫切需要对生姜的综合利用展开研究，以便充分利用姜的有效成分，提高姜的利用价值，推动我国食品调味料和相关食品加工业朝着深加工、方便化、天然健康的方向发展，从而达到与国际接轨。由此可见，在我国进行生姜的综合开发、利用和深加工研究具有很好的经济意义4-6。目前，国外对姜的开发已进入精深加工阶段，广泛利用超临界二氧化碳等现代工艺技术提取姜中的有效成分，制成各种深加工产品，使生姜己经逐渐成为食品工业的重要原料之一。而国内对生姜的加工和利用刚刚起步，加工技术设备相对落后，加工程度低，还没有形成姜的成型深加工产品供应市场。但是，近年来随着人们对自身保健意识的增强，日益强调食品原料及添加剂的天然性与健康性，使得人们再度关注生姜这一药食兼用的食品资源，并以科学手段考察其在保健和预防、治疗慢性疾病方面的功效，应用现代生化及药理技术发现其特定功效成分，不仅为传统中医学治疗实践提供了理论依据，更为宝贵的传统中药走向世界市场打开了大门。由此展开的以姜为原料的深入研究和综合开发，其中所含的多种有效成分都赋予了生姜利用新的内容与意义，如开发其抗氧化性、防腐抑菌性、多种医药保健功能、酶制剂以及研究开发高附加值的第三代功能性天然调味料等等，这些都将为生姜资源的利用开辟无限广阔的前景7-9。要实现生姜资源的综合利用，首先要将生姜中的活性成分进行精细分离，并使之达到一定纯度。对于生物活性物质的分离纯化，主要遵循以下原则，对非极性的成分往往考虑氧化铝或硅胶吸附层析；若极性较大则采用分配层析或弱吸附剂层析；对酸性或碱性成分可用离子交换层析，有时也可用吸附层析及分配层析。对生物碱由于采用氧化铝层析或分配层析较为有利，因此较少用离子交换层析分离。聚酰胺则对多元酚性化合物常有独特的分离效果。凝胶层析用于分离分子大小差别较大的物质10。1.2生姜精油介绍1.2.1生姜精油的主要化学成分及应用生姜精油是从生姜根茎中提取得到的挥发性油分，几乎不含高沸点成分，具有浓郁的芳香气味，为棕色透明油状液体，难溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂，沸点为150-300。其折光率为1.4881.494，旋光度为-28-45，密度为0.8710.88211,12。随着分析手段的不断进步，到如今已发现生姜精油中有100多种组分,主要成分为：倍半萜烯类碳水化合物50%66%，氧化倍半萜17%，其余主要是单萜烯类碳水化合物和氧化单萜烯类8。生姜精油中含有的主要有效成分有姜烯、-姜黄烯、-法尼烯、-没药烯、-水芹烯、-倍半水芹烯、姜酚等（结构式见图1-1），各成分均具有一定的活性和良好的应用价值，其中姜烯是生姜精油的主要成分，具有抗病毒、抗溃疡、抗生育等多种活性，目前主要应用于化妆品和香料工业；-姜黄烯和-没药烯均有良好的抗生育活性；-法尼烯与昆虫的诱导性相关，其氧化产物还是诱导虎皮病发生的重要因素；-水芹烯是一种香料和香料中间体，也是天然的杀虫剂；姜酚具有抗氧化、抗肿瘤、防治心血管疾病等多种用途13-17。鉴于生姜精油中各种化学成分分别具有不同的药用或其他作用，将它们进行精细分离是本领域研究的趋势，所获分离物具有广阔的应用前景。生姜精油是生姜提取物，因而也具有药食两用的性质，随着对其功能成分认识的不断加深、分析测试方法手段的不断进步以及现代加工技术的广泛应用，姜精油的开发利用也在不断的深入，其应用领域和行业也将不断扩展。生姜精油中主要有效成分的结构式如下18： (-)-姜烯 -姜黄烯 -法尼烯-没药烯 -倍半水芹烯 -水芹烯姜酚 姜酮图1-1 生姜精油中主要有效成分结构式Fig.1-1 The structures of main active ingredients of ginger essential oil 1.2.2生姜精油的提取方法由于姜油储藏在根茎角状细胞的空隙中，在根茎的表皮和内部都有分布，在提取姜油前，生姜的不同干燥方式对获得的姜油在组成、质量上有较大的影响，生姜精油的提取目前常用方法主要有：(1)水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法是利用被蒸馏分与水不相混溶，使被分离的物质能在比原沸点低的温度下沸腾，生成的蒸汽和水蒸气一同逸出，经凝结后得到水油两层，从而达到分离的目的。目前挥发油提取中经常采用该方法。从生姜中获取其精油，水气蒸馏法是一种传统方法，在工业生产中广泛应用。优点是工艺简单，成本低，被提取物不易分解等；缺点是受热时间长，产油率低,且姜烯在水蒸气蒸馏时易聚合19。 (2) 溶剂萃取法溶剂萃取法是根据原料中被提取成分的极性、共存杂质的理化特性，遵循相似相溶的原则，使有效成分从原料固体表面或组织内部向溶剂中转移，最后分离脱除溶剂的过程。姜精油是非极性混合物，常用的萃取溶剂为乙醇、氯仿、石油醚等，常用的试验方法为索氏提取法。如陈福北20等利用干黄姜提取姜精油的索氏提取法：取姜黄原料, 装进索氏提取器, 以1:4( w/v)沸点为60-90的分析纯石油醚为提取剂，在浴温为90的条件下, 索氏提取9h以上至浸提筒内溶液无颜色为止，将提取液以水泵减压回收溶剂，计算得率并进行GC- MS分析。结果姜精油产率7.34%，其中姜烯占22.12%。(3)超临界CO2萃取法超临界CO2萃取(supercritical CO2 fluid extraction，SFE)是近年发展起来的一种分离新技术, 它是一种物理分离和纯化方法，以CO2为萃取剂，在超临界状态下，加压后使其溶解度增大，将物质溶解，然后通过减压又将其分离，该过程中CO2循环使用。在压力为8-40MPa时的超临界CO2可以溶解多数非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化合物。超临界CO2萃取具有效率高、有效成分不被破坏等优点，尤其适用于热不稳定性天然产物的分离精制，是目前研究中草药等天然产物成分的重要方法之一21。本实验所用生姜精油即为超临界CO2萃取得到。邹纲明22采用正交试验的方法，确定了超临CO2萃取姜精油的最佳工艺条件：萃取温度40，萃取压力20MPa，萃取时间90min，产率为4.95%。(4) 其他方法现代提取技术又有超声波提取、微波提取、酶法提取和仿生提取等方法，以及对传统方法的改进。孙亚青23等利用同时蒸馏萃取法(SDE)从冷冻干燥的姜中萃取姜精油，取姜粉5.0g与水按比例1g:50ml的料液比混合后置于同时蒸馏萃取装置(likens-nickerson装置)的样品瓶中加热，待其沸腾后在likens-nickerson装置的溶剂瓶中加入10ml重蒸乙醚，50水浴加热，同时保持样品沸腾。提取过程4h。蒸馏结束后为保证提取效果，蒸馏结束后再萃取15分钟。收集likens-nickerson装置中的乙醚提取产物，经冷冻除去水后，用vigreux浓缩柱在50水浴中小心浓缩至0.2ml，置-18冰箱中冻藏。进行GC分析，结果姜烯含量最高达41.22%。1.3姜烯概述1.3.1姜烯的性质姜烯，英文名称：Zingiberene, 属萜烯类化合物24，是生姜精油中的主要有效成分之一，它代表了姜中挥发油的典型气味。姜烯化学名称：5- (1,5-二甲基-4-己烯)-2-甲基-1,3环己二烯；分子式C15H24,相对分子量204.19，结构式见图1-1。与其他精油成分不同的是姜烯含有同环共轭双键，在层析法中吸附解脱能力和其他类型的键以及官能团有所差异，因而可以利用硅胶柱层析法进行分离纯化。1.3.2姜烯的应用价值研究证实，姜烯具有多种生物活性，如抗病毒、抗溃疡和抗生育等，广泛应用于化妆品和香料工业，具有很好的市场前景和应用价值。（1）抗生育应用倍半萜类化合物是避孕药研究方面的一个值得重视的新领域，国内外有文献报道生姜精油具有显著的抗生育活性。倪明红25等以香茅醛为原料合成出姜烯，并以小白鼠为实验对象，对27例怀孕的小白鼠注射剂量0.05ml/10g的姜烯，结果全部零胎，说明姜烯的抗早孕活性令人满意。（2）化妆品领域姜烯具有鲜花的香气特征，同时具有抗氧化的特性，因而应用在化妆品、美容等行业。目前市场上已经有姜烯的美容产品，如姜烯SPA护理膜。（3）香料工业姜烯既可以作为合成其他香料的辅料，也可以姜烯为基础，可以合成出多种香料产品。A. Nirmala26等以姜烯为原料合成出九个化合物的新香料，得到的乙酸酯和甲基醚有非常愉快花香的特征, 羟基化合物以及甲酸酯显示可作为檀香木以及岩兰型香气的代用品。作为生姜精油中的主要倍半萜成分的姜烯，可以合成出多种香料，使得生姜精油的综合利用得到提高。（4）杀虫剂植物挥发性化合物既可以用来直接或间接诱杀害虫，又可以有利于天敌寻找寄主以提高其自然控制的作用。植物挥发性化合物的许多成分能够直接作用于害虫，如柠檬烯、姜烯、香叶烯等对有些昆虫可引起忌避或抗生育作用，能够影响昆虫的生长发育，植物释放的大部分挥发物是单萜烯和倍半萜烯。经研究，番茄对叶蜻、马铃薯甲虫的抗性与姜烯的分泌密切相关，而且姜烯对甜菜夜蛾幼虫的点滴毒力很高，主要表现在取食率、存活率和幼虫体重下降，可见姜烯是一种明显的抗生性物质。因此，了解姜烯对植物与其主要害虫之间相互作用的生态调节作用及其作用的机理已十分迫切。因此姜烯可以作为杀虫药、放水剂和昆虫哺养的威慑物27。1.3.3姜烯的分离纯化方法1.3.3.1硅胶柱层析法层析法是一种基于被分离物质物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。它最大特点是分离效率高，能分离各种性质极类似的物质，而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。孙亚青28等用硅胶柱层析法，能分离超临界萃取所得姜油中的烯类化合物，实验分离得到的混合物中含有31种化合物，主要包括杜鹃烯、姜烯、金合欢烯、-倍半水芹烯、-旅烯、-旅烯、茨烯、-水芹烯、龙脑、松油醇、柠檬烯等单萜和倍半萜类化合物，其中姜烯、金合欢烯、-倍半水芹烯、-水芹烯四种化合物，按面积归一法计算，其峰面积总和共占色谱峰的88.05%。国外的Clive V. Denyer29先后采用硅胶柱、水蒸气蒸馏、闪式硅胶层析、AgNO3-硅胶柱分离生姜精油，从中可分离出较高纯度的姜烯、-倍半水芹烯、-姜黄烯等成分，但步骤多，成本高，回收率低，仅限于实验室研究。因而，有必要对生姜精油的精细分离做进一步研究，以满足工业化生产的要求。1.3.3.2分子蒸馏法分子蒸馏(molecular distillation，简称MD)技术是一种新型的液、液分离或精制技术。当液体混合物沿加热板流动并被加热，轻、重分子会逸出液面而进入气相，由于轻、重分子的自由程不同，因此，不同物质的分子从液面逸出后移动距离不同，若能恰当地设置一块冷凝板，则轻分子达到冷凝板被冷凝排出，而重分子达不到冷凝板沿混合液排出，这样达到物质分离的目的。王发松30等利用分子蒸馏对经超临界CO2萃取的姜精油进行了分离纯化，经GC-MS分析得到各馏分组成如下表1-1，从中可以看出前三种馏分中姜烯的含量都较高（47.45%、56.69%、43.19%）。但生姜精油中同分异构体较多，如姜烯、姜黄烯、没药烯等的分子式都为C15H24，因此馏分中姜烯的纯度不理想。表1-1 姜油分子蒸馏五种馏出物的主要成分及相对含量（%）Tab.1-1 The main composition and relative content (%) of five molecular distillates from ginger oil序号化学成分1-姜黄烯-6.385.264.57_2（-）-姜烯47.4556.6943.19_3-金合欢烯8.737.544.51_4丁香烯14.6420.0320.96_5（6）-姜烯酚_58.9360.596（8）-姜烯酚_5.225.557（10）-姜烯酚_10.7216.018总姜烯酚类化合物_86.0094.921.3.3.3大孔树脂法大孔树脂是20世纪70年代末发展起来的一类有较好吸附性能的有机高聚物吸附剂，其原理是：大孔吸附树脂具有很大的比表面积，是吸附和分子筛原理相结合的分离材料，主要通过分子间作用力对被吸附的分子进行吸附，它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果；另一方面它具有一定的孔径，不同分子大小的化合物经过树脂柱时，树脂又具有一定的分子筛作用。大孔吸附树脂可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物，不同极性、不同孔径的树脂对不同种类的化合物的选择性不同，从而达到分离纯化的目的。通常，以范德华力从很低浓度的溶液中吸附有机物，其吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，表面的亲水性或疏水性决定了它对不同有机化合物的吸附特性。根据树脂的表面性质，可分为非极性、中极性和极性三类。大孔吸附树脂法具有选择性好、易于解吸附、机械强度高、再生处理简单、吸附速度快以及不污染环境等优点，在我国已逐步开始应用于生物资源有效成分的分离、纯化工作中31。在对生姜的研究中，大孔树脂主要应用于姜酚等成分的分离研究，而姜烯只是作为副产物，而且得到的姜烯含量较低，主要是因为生姜精油中与姜烯在分子量、结构等方面相似的成分较多，利用大孔树脂只能将其中的酚类和烯类大致分离，因而很难得到较高纯度的姜烯。1.3.3.4化学反应法姜烯为姜精油中的主要成分，通常很难从姜精油中的倍半萜混合物中分离精制。美国加利福尼亚大学的Jocelyn G. Millar32利用姜烯分子中的共轭双烯基团，选择强亲双烯体4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)与同环共轭双烯姜烯发生Diels-Alder加合反应，加合物浓缩后采用闪式层析法精制，之后还原得到姜烯，加合反应的反应式为：其实验步骤主要为：将姜精油在0.1mmHg下进行Kugelrohr蒸馏。弃去主要含单萜的第一馏分(炉温60)，第二馏分(炉温60-100）几乎全由倍半萜烯组成：-姜黄烯9.2%、姜烯46%、倍半水芹烯17.4%、没药烯10.1%。取部分倍半萜烯馏分加入20mL干燥的THF(四氢呋喃)溶液，室温下搅拌，同时逐滴加入PTAD的THF溶液。所得的混合物浓缩后用闪式层析法精制，用含15%丙酮的己烷溶液洗脱，得到无色胶状加合物3。取加合物0.33g在氩气条件下加入2.1mol/L KOH的95%乙醇溶液10mL，回流3h。混合物冷却并用水稀释，用25mL的己烷提取3次。己烷提取液用饱和NaCl水溶液洗涤及Na2SO4干燥后，通过一个硅胶G的短柱，用己烷洗脱，除去痕量的苯胺，己烷洗脱液浓缩后用Kugelrohr 蒸馏，得到姜烯143mg，通过GC-MC测得其纯度99%。质谱和保留时间都和姜精油中的姜烯数据一致，氢谱数据也和文献数据吻合。化学反应法虽可得到较高纯的的姜烯，但该法步骤多，时间长，成本高，难以在工业生产中应用。1.4硅胶柱层析的原理与技术1.4.1硅胶柱层析的原理在硅胶柱层析中，使用的硅胶是一种坚硬无定型立体网状结构的硅酸聚合物颗粒，硅胶的分子式是SiO2H2O,它的内部具有很多的小孔，这种孔的存在使得硅胶具有很大的表面积。在硅胶颗粒的内部，分子与分子之间的相互作用是对称的，其力量是相互抵消的，而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，表面层所受的作用力小，因此在硅胶固体的表面就存在着这种剩余的力。在一定的条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用，这种作用主要是物理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表面与溶质分子之间的范德华力，如静电力、诱导力、色散力，其特点是吸附速度快，在相同的情况下，吸附过程与脱附过程是同时进行的，被吸附物质在一定的条件下可以被解吸出来。化学作用主要是硅