甘蓝型油菜黄籽高含油量育种资源遗传多样性分析二审通过后改.doc

甘蓝型油菜黄籽高含油量育种资源遗传多样性分析范志雄1,2，雷伟侠1，江莹芬1，李强生1，吴新杰1，陈凤祥1，王汉中2（1 安徽省农业科学院作物研究所，230031，安徽合肥；2 中国农业科学院油料作物研究所，430062，湖北武汉）摘要 油菜高含油量育种资源是高油杂交育种的基础。以2份白菜型油菜为对照，以精测含油量47%作为高含油量指标，通过连续4年定向选择，我们积累了57份总体农艺性状优良的甘蓝型油菜黄籽高油育种资源。我们用SRAP标记为研究了57份甘蓝型油菜黄籽高油育种资源这些育种资源间的遗传关系，用白菜型油菜棕红籽“关中蔓菁”和纯黄籽“巢湖黄籽”为对照，应用SRAP标记分析了59份资源的遗传多样性。结果表明。，在遗传相似系数0.682处，可将59份材料分为3类：两份白菜型油菜聚为一类；甘蓝型油菜除选系Y58单独聚为一类外，其它所有选系归为另一类，显示黄籽高油育种资源遗传基础较窄。在遗传相似性系数0.738处，又可将57份甘蓝型油菜分为6个亚类，其中53份材料归为两个大的亚类，系谱或亲缘关系较近的材料一般聚在同一亚类，且按系谱关系比地理来源划分明显，提示按地理来源配制强优势黄籽高油杂交组合可靠性可能不如按系谱来源。同时发现，虽经高压选择，仍然能从杂交组合的回交及自交后代中筛选出遗传距离相对较远的子代。结合本研究和前人研究成果，提示欧洲冬油菜或者中国白菜型油菜存在拓宽中国甘蓝型冬油菜遗传基础的潜力。关键词 甘蓝型油菜 黄籽 高含油量 遗传多样性 SRAP标记甘蓝型油菜是我国重要的油料作物，大幅增加菜籽油供应总量是保障我国食用油战略安全的重大需求。但长期以来，我国油菜育种主要追求单纯的产籽量，对含油量则由于各种原因未予能给以足够重视。，导致通过杂种优势利用，我国油菜籽全国平均单产已处于较高水平，继续通过育种增加单产有一定难度。与此相对比，我国菜籽的平均含油量在过去20年中仅提高了1-2%，占我国油菜生产面积90%的长江流域主产区菜籽含油量长期徘徊在40%左右1，而加拿大和欧洲等各国菜籽的含油量可达45甚至50。另一个问题是育种实践中利用的强优势材料一般都是先配制大量杂交组合，再经多年多点比较、鉴定才获得，该育种过程太繁琐耗时2。一般来说，亲本间遗传差异越大，杂种优势越强3。因此，利用分子标记研究高油育种资源间的遗传差异，可为选配高含油量强优势组合提供依据，减少配组合时的盲目性。由于同一遗传背景甘蓝型油菜黄籽含油量比黑籽高1.52% -4.26%，因此现有甘蓝型油菜高含油量的遗传改良多集中于黄籽育种途径上4-6。然而自然界中并不存在天然的甘蓝型黄籽油菜，目前培育出的黄籽甘蓝型油菜品种黄籽性状来源十分复杂，原始亲本多为白菜型油菜等近缘种，如宁油10号7，渝黄1号8，9等。通过田间育种施加一定选-作者简介：范志雄，博士后在站，从事甘蓝型油菜高含油量分子育种。 陈凤祥，通讯作者，博士后指导老师，研究方向为油菜遗传育种； 王汉中，通讯作者，博士后指导老师，研究方向为油菜遗传育种。 基金项目：安徽省自然科学基金（090411021），安徽省农科院院长创新基金（11B0201），“863计划”课题（2011AA10A104）如果能将菜籽含油量提高至50，按目前的生产水平，可以年增加100万吨菜籽油，相当于将我国油菜籽产量提高25。因此，将杂种优势与高含油量结合，育成并推广高含油量杂交种将是提高我国油菜产油量的一条重要途径。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)存在较强杂种优势，但长期以来，育种实践中利用的强优势材料一般都是先配制大量杂交组合，再经多年多点比较、鉴定后才获得，该育种过程太繁琐耗时2。一般来说，亲本间遗传差异越大，杂种优势越强3。利用分子标记研究高油育种资源间的遗传差异，可为选配高含油量强优势组合提供依据，减少配组合时的盲目性。同时，因同一遗传背景甘蓝型油菜黄籽含油量比黑籽高1.52% -4.26%，因此现有甘蓝型油菜高含油量的遗传改良多集中于黄籽育种途径上4-6。然而自然界中并不存在天然的甘蓝型黄籽油菜，目前培育出的黄籽甘蓝型油菜品种黄籽性状来源十分复杂，原始亲本多为白菜型油菜等近缘种，如宁油10号7，渝黄1号8，9等。通过田间育种施加一定选择压（抗逆、高含油量等）获得的黄籽高油育种资源，其遗传基础是否丰富，将直接影响到杂种优势利用的效果。本研究利用SRAP标记分析了57份甘蓝型油菜黄籽高含油育种资源的亲缘关系和遗传距离，为高油杂交油菜亲本选配和杂种优势预测提供参考。1 材料与方法11材料 所用甘蓝型油菜选系Y41、Orca、Terra、Campino、Y52-8、Y84、YF406为常规品种或自交系，PolCMS805、PolCMS804和PolCMS1923为温敏型波里马(polima)不育系，人工辅粉自交保存。Y204是204-F14中发现的黄籽选系；Y204B为Y204两型系（A、B系）用沙网袋人工兄妹交中的可育株系；Y204A为Y204AB制种棚繁时选出的黄籽不育系。11个Y9012BDH株系为Y9012B高油黄籽株经小孢子培养后获得的双单倍体选系。其它材料为杂交种（如油研9号5个选系）或杂交组合（包括回交，如Y204A/Y204A/12-12-148）自交分离出的后代。具体选育过程如下：2007年夏观察收获的5054个甘蓝型油菜单株的粒色，挑出黄籽材料用近红外光谱仪（NIR）分析含油量（以下简称粗测），其黄籽标准不追求高黄籽度和黄籽率筛选标准不追求高黄籽度和黄籽率，只要具备黄籽背景只需具备黄籽背景，即可用于粗测。340份粗测含油量47%的单株继续用索氏抽提法精测含油量（以下简称精测），每单株测两次重复，。226份精测含油量确实47%的单株继续种植，田间选择按长势好、双低（低芥酸、低硫苷）、抗倒、抗（耐）菌核病、可育株散粉习性好且结实率高等育种标准施加选择压，保留的材料按上述分析方法测定含油量，留下精测含油量确实47%的材料继续下年种植，如此循环，直至2010年经4轮选择后，留下57份高油（47%）且总体农艺性状优良的材料构成育种资源谱。白菜型油菜（Brassica rapa）2份：“关中蔓菁”来自陕西合阳，籽粒棕红色；“巢湖黄籽”来自安徽巢湖，籽粒纯黄且黄籽率达100%。两份资源自交不亲和，每年手工剥蕾自交保存，粒色遗传稳定。所有育种资源见表1。表1 供试材料系谱及来源田间编号材料系谱来源及习性1Y204B安徽，冬性2油研9号F5贵州，半冬性3油研9号F5贵州，半冬性4油研9号 F5贵州，半冬性5(油研9号 F5贵州，半冬性6Y41浙江，冬性7（Y204A/Y204A/12-148）F5安徽，冬性8(Y204A/12-148) F5安徽，冬性9（Y204A/Y204A/12-148）F5安徽，冬性10(Y204A/12-148） F5安徽，冬性11（Y204A/12-148） F5安徽，冬性12（Y204A/Y204A/12-148）F5安徽，冬性13Y420/宁10B/12-148/204-F14安徽，冬性14（12-148/204-F14/Y204AB） F5安徽，冬性15（Y204A/204-F14) F5安徽，冬性16油85 F5贵州，半冬性177633 F5陕西，冬性187633 F5陕西，冬性19驰丰1号 F5陕西，冬性20驰丰1号F5陕西，冬性212005G203 F5不详，半冬性22瑞油1号 F5四川，冬性23DH1708 F5陕西，冬性24杂79 F5陕西，冬性253378 F5陕西，冬性26ORCA欧洲，春性27(Y204A/ 204-F14/ Y420/宁10A/ 12-148/204-F14) F5安徽，冬性28(Y420/宁10B/12-148/204-F14/12-宁10B) F8安徽，冬性29(Y204A/12-148) F5安徽，冬性30(Y204A/12-148) F5安徽，冬性31（Y420/宁10B/12-148/204-F14）F8安徽，冬性329012A/宁油10号 F5安徽/江苏，冬性33Y58 安徽/欧洲，亲本不详，冬性34双低白花安徽，冬性35Terra欧洲，春性36油研9号 F5贵州，半冬性37Campino 欧洲，春性38PolCMS 805辅粉 湖北，冬性39Y52-8欧洲，春性40Y84欧洲，冬性41Y9012BDH安徽，冬性42Y9012BDH安徽，冬性43Y9012BDH安徽，冬性44Y9012BDH安徽，冬性45Y9012BDH安徽，冬性46Y9012BDH安徽，冬性47Y9012BDH安徽，冬性48Y9012BDH安徽，冬性49Y9012BDH安徽，冬性50Y9012BDH安徽，冬性51Y9012BDH安徽，冬性52YF406安徽，冬性53PolCMS804辅粉湖北，半冬性54YP9012A棚选安徽，冬性55PolCMS1923辅粉湖北，半冬性56Y204A 棚选安徽，冬性5703HF096 F8河南，冬性58巢湖黄籽安徽，白菜型，冬性59关中蔓菁陕西，白菜型，冬性表2SRAP标记的正向引物、反向引物的序列(5- 3)及引物对组合正向引物反向引物引物组合Me1 TGAGTCCAAACCGGATAEm1 GACTGCGTACGAATTATTMe1/Em1, Me2/Em2, Me2 TGAGTCCAAACCGGAGCEm2 GACTGCGTACGAATTTGCMe3/Em3, Me4/Em4 Me3 TGAGTCCAAACCGGAATEm3 GACTGCGTACGAATTGACMe5/Em4,Me6/Em5 Me4 TGAGTCCAAACCGGACCEm4 GACTGCGTACGAATTAACMe7/Em6, Me8/Em7Me5 TGAGTCCAAACCGGAATEm5 AGGCGGTTGTCAATTGACMe9/Em8, Me10/Em9Me6 TTCAGGGTGGCCGGATGEm6 TGTGGTCCGCAAATTTAGMe11/Em10, Me12/Em11Me7 TGGGGACAACCCGGCTTEm7 GACTGCGTACGAATTTATMe13/Em12Me8CTGGCGAACTCCGGATGEm8 GACTGCGTACGAATTTGCMe9 GGTGAACGCTCCGGAAGEm9 GACTGCGTACGAATTGACMe10 AGCGAGCAAGCCGGTGGEm10 GACTGCGTACGAATTTGAMe11GAGCGTCGAACCGGATGEm11 GACTGCGTACGAATTCATMe12TACGACGAATCCGGACTEm12 GACTGCGTACGAATTCTAMe13CACAGTCATGCCGGAAT1、2 基因组DNA提取2010年收获的57份甘蓝型油菜黄籽高油育种资源与2份白菜型油菜种籽置发芽盒中25暗培养，取子叶参照CTAB法10提取基因组DNA。纯化后的DNA加适量TE缓冲液回悬DNA，电泳检测其质量，-20储存备用。1、3 SRAP标记的扩增与检测扩增反应参照Li和Quiros11，扩增产物电泳分离与检测参照陆光远等12。Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司。SRAP引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物及其组合见表2。1、4 数据统计与分析 仅读取100-800bp之间清晰易于识别的条带，有带记为1，无带记为0，缺失记为2。采用Nei和Li的公式计算相似性系数(GS)和遗传距离(GD) 13：GSij = 2Nij/(Ni+Nj+Nij) GDij = 1GSij其中Nij为共有带数, Ni、Nj分别为第i个材料和第j个材料各自的特有条带数。运用NTSYSpc2.10e软件对数据进行分析，, 按照非加权成对算术平均法(UPGMA)以相似系数对参试材料进行聚类作图。2 结果与分析2、1 SRAP标记多态性 在所有59份材料中，13对SRAP引物组合全部能扩增出多态性位点，清晰易读的多态性位点达103个，平均每对约8个。扩出多态性最多的为Me12/Em11引物组合，达13个；最少为Me7/Em6，仅1个多态性位点。在这103个位点中，甘蓝型油菜能扩出而2份白菜型油菜均未扩出的位点为55个，占53.4%；甘蓝型油菜未能扩出而2份白菜型油菜均能扩出的位点为2个，提示这2个位点可能为白菜型油菜A基因组所特有。2、2聚类分析UPGMA聚类分析表明，在相似系数为0.682处，可将所有59份材料分为三大类：第一类如同预料第一类如同预期，由两份白菜型油菜组成；第二类只有甘蓝型油菜Y58（(33），)，来自于安徽与欧洲油菜品种杂交分离后代（亲本名称不详）；第三类包含除Y58的所有56份甘蓝型油菜。其中，第三类在相似系数0.738的水平上处又可进一步分为5个亚类，所包包含的选系数分别为30，21，2，2和1个。从聚类结果可看出：（1）白菜型油菜与甘蓝型油菜聚类时归为不同类，符合两者在植物分类学上分属不同种的结论。此外，与甘蓝型油菜相比，即使属同一个种，关中蔓菁与巢湖黄籽间遗传差异仍较大（聚类图上节点出现相对较早）；（2）甘蓝型油菜系谱或亲缘关系较近的材料多聚在一起。例如，均含选系204-F14背景的选系8，10，12，13，14，15，27，28，29，30，31聚于一亚类，。此外，Y204B与Y9012BDH也聚于同一亚类，田间性状相似，我们的系谱分析也发现两者均含加拿大春性品种“Westar”血统。同时，另外四份国外春性品种（系）Orca(26（编号26）)、TerraTerra（( 35编号35）)、CampinoCampino（( 37编号37）)和Y52-8Y52-8（(39编号39）)均聚于此亚类而未分散到其它亚类，暗示春油菜遗传基础可能比国内冬性品种窄，这与前人研究结果一致14。（3）同一地区来源的姊妹系聚类时距离较近，但不同地理来源的选系也可能聚在一起。长江上游贵州的“油研9号”5个姊妹系（编号2、3、4、5和36）聚于一起，并且“油研9号”与同样来自贵州的油85“油85（(16编号16）)”在图中距离较近；来自黄淮区陕西的“7633（(17、18）”、“)、3378（(25）”、“)、杂79（(25）”、“)、驰丰1号（(19、20）”)和“DH1708（(23）”)距离较近，并且与同属黄淮区河南的“03HF096（(57）”)归为此亚类。虽然来自贵州与陕西的资源生态型明显不同，但这两个地理来源的选系却聚于同一亚类，这种现象其他研究人员在研究国家冬油菜区试新品种的遗传关系时也有发现15。（4）少数材料遗传背景可能存在特异性，反映在聚类图上各自归为一类。如“PolCMS 805”（(38）)和“PolCMS 804”（(53）)两者组成一类，除其来源为湖北外，可能还与其属polima不育系背景有关；具Y204背景的7和11、以及中欧杂种分离后代Y58（(33)）Y58（编号33）分别单独聚为一类，推测可能原因为分离过程中遗传重组较大。3 讨论黄籽油菜种皮薄，油质清亮，种皮对加工品质影响小16。作为油料作物，大幅提高产油量是增加油菜产品附加值的主要目的，黄籽育种则是提高含油量的一条便捷途径。2009年国家冬油菜区域试验参试材料平均含油量约42%17，笔者在从黄籽资源中选育高含油量资源时，在此基础上再增加5%（相当于产籽量增加10%-12.5%）即以47%以上作为高含油量指标，选育出57份育种资源。通过4年严格的育种选择，从大量黄籽遗传资源中获得了57份高含油量育种材料，这些材料农艺性状总体优良，遗传相对稳定，可以作为杂交育种的亲本。对这些资源对它们相互之间的遗传关系进行研究，可以为高油杂交组合选配提供依据。本研究基于SRAP标记的遗传多样性分析结果表明，这些资源间的遗传基础相对较窄。这一结果与陈玉峰等18结论相反，原因可能为本研究所用材料是经严格选择的育种资源，这种选择压虽然可以产生可供育种直接利用的亲本材料施加选择压虽然可以产生可供育种直接利用的亲本材料，但却是以牺牲遗传多样性为代价的。而陈玉峰等研究的40份材料高油标准仅为43%，即使在含油量47%以上的22份材料中，还包括有Gaoyou19等不能直接用作杂交种亲本的双高品种（高芥酸，高硫甙）和Sollux19等11份从国外引进的高油材料，更低的含油量标准和相对比例较高的国外资源组成的供试群体拓宽了其遗传基础。事实上，关于甘蓝型油菜遗传基础，不同的研究得出了“丰富”18-20和“狭窄”14,21两种完全相反的结论。但是，比较他们的研究群体，我们发现前者均用了较高比例的国外资源。这也暗示我们，国外资源特别是欧洲冬性高油资源有可能用于拓宽我国高含油量育种资源的遗传基础，这一点本研究中Y58（(33编号33）)单独聚为一类就是从中欧杂种分离后代中选育出的农艺性状适合安徽生态条件且遗传距离较远的选系就是例证。两份白菜型油菜关中蔓菁和巢湖黄籽分别为陕西关中和安徽巢湖地区的农家品种。其中关中蔓菁在进化上起源较早22，具有抗冻耐旱且早熟的优点。巢湖黄籽籽粒纯黄无杂班，且籽粒较大。作为近缘种，利用远缘杂交技术向甘蓝型油菜导入抗冻、耐旱、早熟等一系列优良性状，有可能从后代中选育出遗传距离较远的黄籽高油新型甘蓝型油菜，相关工作正在进行。目前，本研究中甘蓝型油菜育种资源虽然遗传基础较窄，但亚类间仍可配制出强优势高含油量杂交组合。例如，田间观察发现组合“瑞油1号F5/Y204B”和“PolCMS1923/Y52-8”就表现出较强的杂种优势。因此，今后工作中根据此聚类结果直接配制亚类间杂交组合（包括利用化杀杂种和雄性不育系统杂交种）可大大降低配组合的盲目性。另外，传统思路依据地理来源法配强优势杂交组合时，会优先考虑贵州选系与陕西选系间的杂交，但分子聚类结果则发现两者亲缘关系较近，暗示传统做法效果可能不佳。图1 采用UPGMA法依据SRAP标记遗传相似系数对57份甘蓝型油菜黄籽高含油量育种资源和2份白菜型油菜的聚类图（NTSYSpc2.10e）参考文献1 傅寿仲,张洁夫,戚存扣,等.甘蓝型油菜高含油量种质选育研究.中国油料作物学报,2008,30（3）：279-2832 沈金雄,傅廷栋,杨光圣.甘蓝型油菜SSR、ISSR标记的遗传多样性及其与杂种优势的表现.中国农业科学,2004,37（4）:477-4833 Brandl J E, Mc Vetty P B E. 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