离子导入法对甘草次酸透皮吸收的影响 (2).doc

题 目 离子导入法对甘草次酸透皮吸收的影响 目 录摘要1英文摘要11 文献综述11.1 甘草次酸的功效11.1.1 抗心律失常作用21.1.2 抗免疫作用21.1.3 抗炎作用21.1.4 镇痛作用21.1.5 抗溃疡作用21.1.6 抗肿瘤作用21.1.7 镇咳、消痰21.2 透皮吸收31.2.1 透皮吸收的原理31.2.2 透皮吸收的优点31.2.3 透皮吸收的研究现状31.3离子导入法41.3.1 离子导入法的原理41.3.2 离子导入法的优点41.3.3 离子导入法的研究现状42 引言53 实验材料与方法53.1 实验试剂及仪器53.2 实验方法53.2.1 甘草次酸最大吸收波长的测定紫外分光光度法53.2.2 甘草次酸标曲的建立63.2.3 离体鼠皮的制备73.2.4 体外释放73.2.5 药物通透性的参数表征-累积透过量的计算84 结果与分析84.1 甘草次酸透皮吸收实验数据84.2 离子导入法对甘草次酸透皮的影响95 结论与讨论115.1 结论115.2 讨论11参考文献12致谢14离子导入法对甘草次酸透皮吸收的影响王欢（农学院中药学2008-1班）摘 要 目的：考查离子导入法对甘草次酸透皮吸收的影响。方法：以甘草次酸为药物模型，配成1mgml-1溶液加入到智能透皮仪的扩散室中，作为扩散液，在1，2，3，4，6，8h时吸取3ml离子导入组和对照组接受池中释放液样品，再加入相同体积的释放液，利用紫外可见分光光度计测定所取样品吸光度，计算出甘草次酸的透过率，透过率大的，吸收效果好。结果：对照组的甘草次酸的透过率为109.31，离子导入组的透过率为226.53。结论：离子导入组甘草次酸透皮量比对照组透皮量大，说明离子导入法能促进甘草次酸的透皮吸收。关键词: 离子导入；甘草次酸；透皮吸收Effect of Ionophoresis on the Transdermal Absorption ofGlycogenetic AcidWANG Huan(Traditional Chinese Materia Medica 2008-1 of Agronomy College)Abstract Objective: We aim to evaluate the effect of iontophoresis on the transdermal absorption of glycogenetic acid.Methods: Glycogenetic acid is maked up 1mgml-1 and put into the above of automatic diffusion apparatus as the model drug.The samples are withdrawn from the ionophoresis group and control group at 1,2,3,4,6,8,10 hours,and the same amount of glycogenetic acid is determined.The samples are measuredby UV-Vis spectrophotometer,then the transmittance of the glycogenetic acid is compared,the more transmittance,the more effect.Results: The transmittance of control group is 109.31,and the ionophoresis group is 226.53.Conclusion: The transmittance of ionophoresis group is more than the control group,and iontophoresis group can promotetransdermal absorption of glycogenetic acid.Key Words: Iontophoresis; Glycogenetic acid; Transdermal1 文献综述1.1 甘草次酸的功效 甘草(Mycorrhizal)为豆科植物，其主要有效成分为甘草次酸（Glycogenetic acid）。中医理论认为：甘草性平味甘，具有和中缓急、润肺、解毒、祛痰、通经脉、利气血、调和诸药等功效，在临床上广泛应用。其主要成分甘草次酸1具有以下药理作用。1.1.1 抗心律失常作用 10mg/kg、20mg/kg甘草次酸均能明显对抗乌头碱20g/kg，Bacl2 2mg/kg和结扎左冠状动脉前降支能诱发大鼠的室性心律失常(P0.01)。离体研究表明，甘草次酸不但可延长乌头碱诱发的心律失常潜伏期，还能增加由哇巴因诱发的室性心律失常的阈值2。1.1.2 抗免疫作用 通过考察甘草次酸对大鼠新生血管化角膜模型行穿透性移植术后免疫抑制的影响，发现甘草次酸能够抑制T淋巴细胞和巨噬细胞的活化，增殖，还能强化地塞米松的效果，发挥抗免疫的特性3。甘草次酸还能使大鼠肝线粒体溶胀、丧失膜电位、吡啶核酸氧化,并且产生以氧为中心的氧化反应。这可能是甘草次酸诱导癌细胞凋亡的第一步反应4。1.1.3 抗炎作用 甘草次酸对大鼠棉球肉芽肿、甲醛性浮肿、皮下肉芽肿性炎症都有一定的抑制作用5。Sukiyaki6等认为甘草次酸的抗炎作用是通过抑制与花生四烯酸发生级联反应的代谢酶一磷酯酶赴和脂加氧酶的活性完成，使得前列腺素炎性介质无法产生，从而抑制前列腺素的合成与释放，从而产生抗炎效应。1.1.4 镇痛作用 腹腔注射醋酸引起小鼠扭体反应的实验中，用甘草次酸、11-脱氧甘草萜醇及其衍生物c和b，灌胃小鼠，可产生镇痛作用。此外，甘草次酸不但能抑制胃，肠平滑肌的收缩，而且对子宫平滑肌收缩也有抑制作用，临床用于治疗脘腹挛急作痛等症7。1.1.5 抗溃疡作用 Revers是第一个研究甘草的抗溃疡作用的人8。Allemande研究发现3-乙酰基-18-甘草次酸用于治疗十二指肠溃疡、胃溃疡，疗效明显。消化性溃疡是由于对粘膜具有损害作用的侵袭因素与粘膜自身的防御因素之间失去平衡的结果，具有保护作用的因素主要有粘膜屏障，粘液-重碳酸盐，粘膜血流量，PGE2，表皮生长因子等9。1.1.6 抗肿瘤作用 1985年日本的Awaking研究发现10，甘草次酸对鼠类皮肤瘤的增生有抑制作用。Finishing和Hoyden等对甘草次酸衍生物进行了广泛的研究，发现齐墩果烷烯和23,28-三醇具有比甘草次酸有更强的抑制由病毒引起的肿瘤增生效果。Ios.si等11检测了GL和180r-GA对人肿瘤细胞株MCF-7、Hep-2和Aero的影响，结果发现甘草次酸可引起MCF-7细胞凋亡，但对Aero细胞株没有表现出细胞毒作用。1.1.7 镇咳、消痰 吴勇杰12通过实验证明，甘草次酸有镇咳、消痰作用。其镇咳作用虽然弱但有不成瘾的特点；抗炎症介质引起的气道阻力增加，镇咳及消痰等作用将对呼吸道炎症引起的痰、咳、喘等产生抑制作用。1.2 透皮吸收1.2.1 透皮吸收的原理 透皮药物传递系统（transdermal therapeutic systems）又称经皮给药（transdermal drug delivery systems），是指药物以一定的速率通过皮肤，经毛细血管吸收然后进入循环而产生药效的一类给药方式。它包括应用于皮肤上产生局部作用的各种制剂。药物透皮给药系统作为药剂学中的一个新兴的领域，被认为是第四代制剂研究重点13。1.2.2 透皮吸收的优点 经皮给药系统研究和开发的迅速发展，是由于它具有独特的优点：经皮给药可避免肝脏的首过效应和药物在胃肠道的降解，从而使药物的吸收不受胃肠道因素的影响，以此来减少用药的个体差异；一次给药可以长时间使药物以恒定的速率进入人体内，减少给药次数，延长给药间隔；可按需要的速率将药物输入人体内，维持恒定的有效血药浓度，避免了口服给药引起的血药浓度峰谷现象，降低了毒副反应；使用方便快捷，可以随时中断给药，去掉给药系统后，血药浓度很快就会下降，特别适合于婴儿、老人或不宣口服的病人。 正由于这些优点，透皮给药是目前药剂学研究的热点之一。它为不宜口服或者注射的药物提供了一个全身用药的方式。在经皮给药的研究中，对药物的理化性质有严格的要求，如适宜的分子量、溶解度和酸碱度等等，而皮肤的结构和人体的生理状态又使得许多药物不容易通过皮肤扩散、穿透、渗透和吸收。并且药物在皮肤中的渗透速度存在着个体差异及身体不同部位之间的差异。人体不同部位的渗透速度不一样，由高到低依次为：耳后、阴囊、腹股沟、头皮、足背、前臂、足底。增加经皮给药的有效给药面积和提高药物的透皮速率都可以促进药物的透皮吸收，然而经皮给药的给药面积有限，因此要求提高药物的透皮速率。1.2.3 透皮吸收的研究现状 如何克服皮肤的屏障作用，促进药物在一定时间内透皮渗透达到治疗量，是经皮给药研究的关键。它包括物理方法、化学方法和药剂学方法。目前研究得最多的化学方法是使用渗透促进剂；药剂学方法是对药物化学结构的改造，如合成有较大透皮速率的前体药物，使用微乳、脂质体等技术；而对蛋白质等水溶性大分子药物，离子导入和超声波等物理方法应用的较多。 药物透皮给药系统作为药剂学的一个新兴的领域，被认为是第四代制剂研究的重点14。自1981年第一个经皮给药系统一东莨菪碱经皮吸收贴剂上市以来，国内外市场上己相继有十种产品脱颖而出，特别是硝酸甘油、消心痛、雌二醇、芬太尼、可乐定和睾酮等透皮制剂的问世，越来越显示出这种新剂型的优越性和发展潜力。1.3 离子导入法 透皮给药的研究关键是克服皮肤对药物的屏障作用，从而增加药物透皮速度或增加药物透皮量15-19。目前研究比较多的促进药物透皮吸收的方法有添加渗透促进剂、超声波导入、离子导入、脂质体电致孔等18。1.3.1 离子导入的原理 离子导入技术（Iontophoresis）是在低压驱动下(一般情况下透皮电压Buskin低于5V，电流密度小于0.5mA/cm2)，促进药物特别是可解离药物通过皮肤附属器(如汗腺、毛囊等)的渗透率，达到增强药物经皮渗透的目的15。它是将正负电极紧贴到皮肤表面，在恒定外加电流的作用下，使荷电药物穿过皮肤进入人体内。离子导入法受到渗透药物的极性、价位、离子迁移率、渗透组分的组成和电流大小等许多因素的影响20。 离子导入法使药物透皮吸收增加的机理为：所使用的电流能引起皮肤性质发生变化（也称皮肤的流动性）；能增加离子化药物分子的驱动力（也称电因素）；利用自流电场（或低频脉冲电场）的作用和电荷同性相斥、异性相吸的特性使药物离子进入人体内；使水的流动性增加15。1.3.2 离子导入的优点 离子导入系统有三个部分组成，分别是离子导入仪、电极和药物贮库。离子导入法除具备透皮给药的特点外，还具有其独特的优点:以所需要的治疗速度按程序传递药物来降低药物过量和剂量不足；导入机体的是纯药物离子，也就是能起主要药理作用的部分，而不是整个化合物；用自流电导入机体的药物，在体内保留的时间较长，因而作用持续时间也较长；必要时只需停止电离子导入，终止药物传递就能很快结束治疗；它是全身性透皮给药的装置，属于透皮吸收新剂型的范畴，特别适用离子型和大分子多肽类药物的透皮给药；物装置体积小，因此可以制成便携式装置，当离子导入仪与生物传感器配合使用时，即可根据“生物反馈控制”释药原理设计释药装置，发展成为以病人自体信号调节给药速度的最新型控制给药系统。1.3.3 离子导入的研究现状 运用离子导入法，能有效地促进一些药物，特别是离子型药物及多肽类大分子的透皮吸收21。近年来离子导入技术主要运用于改进胰岛素、加压素、肝素、促黄体生成素释放激素等多肽和蛋白质大分子药物经皮吸收，和使用皮肤渗透促进剂相比，离子导入法不引起皮肤的生理生化改变。 离子导入技术在1936年开始正式进入临床治疗应用。Bimbashi等首先使用该技术来阻塞汗腺，治疗手脚多汗症，迄今这种治疗方法仍在广泛应用；1959年Gibson和Cooke利用该种治疗法，输入毛果芸香碱来增加出汗，收集汗液，分析其中氯离子和钠离子的浓度而诊断胰腺囊泡纤维变性症，这一诊断方法被美国FDA认可。此后，在19571967年间，一些局部麻醉用药物、金属离子和非金属离子、血管紧张素和甾体化合物等先后采用离子导入技术来进行局部皮肤或组织疾病的治疗。2 引言 甘草是中国医药宝库中应用最广的一种中药材，它含有很多的活性成分，据现有资料报道，国内外学者已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物、60多种三萜类化合物及香豆素类、18种氨基酸、雌性激素、多种生物碱和多种有机酸等，其主要成分甘草次酸更是具有抗心律失常，抗免疫，抗炎，镇痛，抗溃疡，抗肿瘤等作用，对于现代医学，疾病的防治与治疗有很大帮助。因此，国内外很多这方面的学者都致力于研究怎样提高甘草次酸的吸收率，发挥其最大的疗效。而药物透皮给药系统作为药剂学的一个新兴的领域，可通过添加促进剂、脂质体、超声波导入、离子导入、电致孔等在一定程度上提高药物透过率，从而提高其疗效，这一技术已被广泛应用。目前国内外已经有人用透皮吸收法对布洛芬微乳，乳康巴布膏，N-三甲基壳聚糖等进行了研究，效果都很好。本研究就以草次酸为模型药物，考察了离子导入法对甘草次酸透皮吸收的影响。目的在于探究甘草次酸透皮给药的规律及内在机理，从而为甘草次酸透皮给药系统的开发积累数据。3 实验材料与方法3.1 实验试剂及仪器 仪器：智能透皮仪（YB-P6，天津市鑫洲科技有限公司）；小型离子导入仪（郑州汇豪科技有限公司）；电子分析天平（BS110S，北京赛多利斯天平有限公司）；紫外分光光度计（TV-1901，京普析通用仪器责任有限公司）；电热恒温水浴锅（HWSY11-K，北京市长风仪器仪表公司） 试剂：甘草次酸，磷酸二氢钾，氢氧化钠，甲醇，生理盐水 动物：昆明小鼠（军事医学科学院实验动物中心）3.2 实验方法3.2.1 甘草次酸含量测定检测波长的确定 将甘草次酸溶解在pH7.4PBS中，紫外分光光度计在200400nm之间进行扫描，得出其紫外吸收光谱（图1），确定其最大吸收波258nm，即为甘草次酸含量测定波长。图1 甘草次酸紫外扫描谱Fig.1 The UV wavelength scanning of glycogen acid3.2.2 甘草次酸标准曲线的建立 精密称取0.0052g甘草次酸，加甲醇定容至25ml，配成浓度为20.8mg/ml的母液，分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀释成浓度为4.16，8.32，12.48，16.64，20.80，24.96g/ml的系列浓度，在检测波长258nm处测其Abs值，并以Abs对浓度作图绘制标准曲线， y=0.0205x+0.0365（R2=1），在4.16-20.8g/ml范围内线性关系良好，如图2。图2 甘草次酸标准曲线Fig.2 The standard curve of glycogen acid3.2.3 离体鼠皮的制备 取小鼠，颈椎脱臼致死，剪去腹部毛，剥离腹部皮肤，用蒸馏水和生理盐水反复冲洗干净备用。置于保鲜膜内，4 冷藏备用。3.2.4 体外释放 透皮吸收扩散装置分为上下两室。上室为扩散室，下室为接收室，在接收室底部连有一个取样管，供取样、补充接收液和排除气泡用。接收室可容纳10ml液体，扩散室可容纳3ml液体。扩散室和接收室之间渗透面积为0.95cm2（图1）。 YB-P6型智能透皮吸收仪可同时放置6个样品，分为二组，分别为：单纯甘草次酸透皮吸收组（1-3号3个样品）、甘草次酸透皮吸收+离子导入组（4-6号3个样品）。图3 透皮吸收装置图Fig.3 The set-up diagram on the transdermal absorption 将小鼠皮肤固定在扩散池的一端，使皮肤表层面向扩散室，真皮一侧与接收液接触。量取3ml甘草次酸溶液（1mg/ml）置于扩散室中，接受池中精密加入10mLpH7.4PBS（液面要与皮肤内层接触），放入磁子，保持恒速搅拌（200r/min）和恒温。水温保持在371（此时皮肤温度大约是32 ，与体表温度一致），加样平衡15min开始计时，于1、2、3、4、6、8 h从接收室取样3ml，同时补加等体积预温至37 的pH7.4PBS。所取样品用紫外分光光度法在258nm处检测。离子导入组需将离子导入仪的正、负电极浸入扩散室中，用扭针固定好，正负电极间不要接触。3.2.5 药物通透性的参数表征-累积透过量的计算 甘草次酸的累积透过量按下式计算： Qn为累积透过量（g/cm2）；V为接收室中接收液体积（ml）；C为第n个取样点测得的浓度（g/ml）；Ci为第i个取样点测得的浓度（g/ml）；V0为取样体积（ml）；A为有效透皮面积（cm2）。 以t时刻药物通过皮肤的累积透过量Qn对时间t作图，可得Q-t释放曲线，该直线斜率即为药物的稳态流量（Jss，即稳态经皮吸收速度）。Jss值大，表示药物容易透过皮肤。4 结果与分析4.1 甘草次酸透皮吸收实验数据 在紫外分光光度计下，测得各个时间点的吸光度，如表1。表1 甘草次酸透皮吸收各时间点的吸光度Table 1 The absorbance of mycorrhizal on the transdermal absorptionat all the time points_ 1Abs) 2(Abs) 3(Abs) 4(Abs) 5(Abs) 6(Abs) _ 1(h) 0.351 0.355 0.352 0.425 0.458 0.4622(h) 0.41 0.399 0.405 0.538 0.603 0.6183(h) 0.503 0.495 0.508 0.812 0.785 0.7964(h) 0.524 0.562 0.543 1.152 1.02 0.9846(h) 0.632 0.651 0.618 1.254 1.283 1.2798(h) 0.718 0.703 0.725 1.328 1.352 1.345 将表1中吸光度数据带入到标准曲线里即y=0.025x+0.0365里，计算出此时间点所对应的浓度，如表2。表2 甘草次酸透皮吸收各时间点的浓度Table 2 The consistency of mycorrhizal on the transdermal absorption at all the time points _ 1(ug/ml) 2(ug/ml) 3(ug/ml) 4(ug/ml) 5(ug/ml) 6(ug/ml) 1(h) 15.725 15.923 15.771 19.428 21.074 21.2782(h) 18.678 18.121 18.42 25.076 28.328 29.0793(h) 23.32 22.929 23.572 38.775 37.425 37.9734(h) 24.371 26.273 25.328 55.775 49.176 47.3746(h) 29.773 30.728 29.07 60.872 62.327 62.1228(h) 34.078 33.323 34.424 64.578 65.771 65.424.2 离子导入对甘草次酸透皮的影响 将表2个时间点的浓度带入公式中，可计算出此时间点的累计透过量，如图4。图4 离子导入对甘草次酸透皮吸收的影响（累积释放量）Fig. 4 The effect of iontophoresis on the transdermal absorption of glycogenetic acid(cumulative release) 以累积释放量对时间t作图，可得Q-t释放曲线，该直线斜率即为药物的稳态流量即Jss，如图5。其中未加离子导入的Jss为109.31，施加离子导入的Jss为226.53，是未加离子导入时的2.07倍。图5 离子导入对阿魏酸透皮吸收的影响（Ass）Fig. 5 The effect of iontophoresis on the transdermal absorption ofglycogenetic acid(Ass)5 结论与讨论5.1 结论（1）离子导入组在每个时间点甘草次酸的透皮吸收量都比对照组高，且随着时间增长趋势越来越大。（2）离子导入在一定程度上能增加甘草次酸透皮吸收，为甘草次酸外用制剂的研发提供了理论依据。5.2 讨论（1）以往实验中，一般都采用高效液相法测定甘草次酸含量，操作简单，准确性好，重复性好，但由于本实验采用的样品不纯，杂质峰比较乱，且配制的浓度比较大，而紫外分光光度法的原理则是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁，在本实验浓度下选择紫外分光光度法比高效液相法测定结果更准确些。（2）由实验数据可看出离子导入组比实验组甘草次酸透皮吸收量多，但有些时间点的三个平行数据间误差比较大，如对照组第2h时吸光度分别为0.583,0.603,0.618，重复试验，还是会出现这种情况，可能是因为紫外分光光度法测定数据没有高效液相法准确性高，也可能是透皮仪器的误差，还有待考究。参考文献1 胡志厚.甘草次酸类药物的研究及应用J.药学学报,1988,3(7):553-5602 谢世荣.甘草次酸抗心律失常作用的实验研究J.医药导报,2004,23(3):141-1423 李红.甘草次酸抑制大鼠新生血管化角膜穿透性移植术后排斥反应的免疫病理研究J.中国中医眼科杂志,2002,(1):28-304 Mauro S,Cristina F,Dec io A,el a1.Glycogenetic acid induced permeability transition in ratliver mitochondria.Ischemia PharmacologicJ.2003,66(12):2375-23795 谢世荣.甘草次酸对大鼠心室肌细胞L型钙离子电流的影响J.医药导报,2005,24(8):93-956 Sukiyaki K,Abe Y,Shamashim,et a1.Separation ofphospholipaseA2 in Habu snake venom by moralizingly(GL)affinity chromatographer and identification of a GLsensitive enzymeJ.Biol Charm